造血干细胞表型及分离纯化方法.ppt

造血干细胞表型及分离纯化方法 一个多世纪前 由Arturappenheim 1870 1916 提出 是一类同时具有自我更新和向各系血细胞分化能力的原始细胞群 HematopoieticStemCell 支持干细胞存在的初始证据 1 从小鼠独特的染色体标记中证实 存在能同时产生淋巴和髓系细胞的多能干细胞 pluripotent 2 慢性髓性白血病同工酶分析可见 B淋巴细胞和髓样细胞都来自慢性髓性白血病干细胞克隆 3 用带有新霉素抗性基因标志的逆转录病毒载体转染鼠骨髓细胞 分析病毒特异聚集部位证实 不同淋巴和髓系表型的细胞来自同一干细胞 4 鼠胎肝造血祖细胞体外单细胞培养可生成髓系和粒系细胞 缺乏辨认 计数干细胞的手段 干细胞的辨认仅靠体外克隆形成分析和估算如 CFU GM CFU Mix Civin等制备出一株鼠抗人髓系白血病细胞单抗 My 10 当时称KG la 该抗体可与所有造血前体细胞 progenitors 特异结合 过去干细胞研究进展缓慢的原因 之后 其他研究小组也相继研制出12 8 BI 3c5 ICH 3等类似抗体 1986年 这些抗体被命名为CD34 为目前公认的干细胞的重要标志 CD34抗原的发现促进了造血干细胞研究的深入和发展 是一重要的里程碑事件 一 造血细胞的表型CD34 Sca 1 Thy 1 Lin c kit二 造血细胞分离方法FACS 磁柱分离 亲合分离 Panning 本次课的主要内容 一 造血干细胞表型 免疫技术 克隆技术 流式细胞分类术等的发展 促进了干细胞的研究 相继发现许多干细胞特有的表型 phenotype 如CD34 Sca 1 Thy 1 Lin c kit等 1 CD34的生物学特性 一 CD34 基因定位Chromosome1 1q32 human 也有报道位于1q12qter与CD45及一些其它膜蛋白家族毗邻 全长 spans 26 28kb human 编码序列含8个exons 第1和8个exon编码翻译区和部分非翻译区 2 7个exons仅编码翻译区 也有报道人CD34基因全长38kb 基因长度 在cytoplasmicdomains 人 鼠CD34基因的同源性达90 以上 这种同源性在N末端逐渐减少为45 左右 人 鼠CD34基因的同源性 分子量为105 120kd 人CD34cDNA转录翻译的多肽链长373个氨基酸残基 是一跨膜蛋白 CD34分子的大小 N端为20aa的信号肽 含有大量的serine threonine 胞外区258aa 跨膜区22aa 胞内区73aa 不同部位AA的长度为 所谓表位是指同一抗原分子上有不同的抗原识别位点 目前有My 10 BI 3c5 12 8 ICH 3 TUK 115 2等单抗识别的位点 前四株识别的表位取决于sialicacidresidues 后二者却不一样 CD34分子的epitopes 根据对neuraminidase和glycopotease的敏感性不同 对GPAs敏感 对NAAs敏感性不同 My 10 BI 3c5 12 8 ICH 3 对GPAs NAAs都敏感 TUK3 115 2 8G12 对NAAs不敏感 对GPAs敏感 QBEND 10 CD34表位分三类 许多CD分子既是细胞分化的标志也是功能的标志 CD34分子的确切功能目前尚不完全清楚 但已发现具有以下功能 2 CD34的功能 1 粘附功能 与stromalcell粘附 电镜发现CD34分子浓集在内皮交叉膜 interdigitatingmembrane 的micro processes 此部位是白细胞结合并迁移到血管外的重要部位 CD34分子的结构可能影响其与细胞的粘附 此外 淋巴内皮小静脉粘附实验表明 由重组L selectin识别的一种内皮糖蛋白的硫化碳水化合物 其氨基酸的序列与CD34一致 因此 CD34分子至少可作为L selectin的配体 协助干细胞与基质细胞接触和粘附 干细胞越原始 表面CD34分子密度越大 细胞分化到形态学发生改变时 表面CD34分子表达逐渐减少 直至消失 推测 在造血早期 CD34分子的作用可能与干细胞之间或干细胞与基质细胞之间的接触 通信和相互作用有关 2 细胞间接触 通信和相互作用 Civin小组证实 CD34可由激活的PKC迅速磷酸化 激活的PKC能刺激CD34阳性前体细胞CD34上调 这种上调独立于内质网内CD34的转录和转换 可见 CD34磷酸化是细胞表面上调的扳机 PKC活化是生长因子配体 受体结合启动胞浆信号转导级联的一个成分 3 在细胞信号传导中的作用 外周血单核细胞约为0 1 破骨细胞 osteoclasts 骨髓基质前体细胞 外周神经鞘细胞 成纤维细胞 血管内皮细胞等也发现有CD34抗原表达 骨髓单核细胞约为1 3 3 细胞CD34的表达 一些恶性疾病 如AML 早前 前和急性T淋巴细胞白血病细胞都有CD34抗原的表达 在成人AML中 外周细胞CD34的表达预示患者对系统治疗反应较差 完全缓解率及存活率低 传统的化疗方案治疗效果可能不好 根据细胞表面抗原表达的情况 可将CD34阳性细胞分为许多亚群 这些细胞多数已定向到特定细胞系 与CD34共表达 可作为干细胞进一步分型依据的抗原有 CD38 CD10 CD19 CD5 CD7 CD71 CD45 CD41 CD13 CD33等 4 CD34阳性细胞亚群 不同CD34阳性细胞亚群 CD34 CD38 CD34 CD38 CD34 CD10 CD19 前B CD34 CD5 CD7 前T CD34 CD71 CD45RO 红前 CD34 CD41 巨前 CD34 CD13 CD33 CD45RA 髓前 CD34hiLin HLA DRlowThy 1 CD45RO Rhodull 较原始干细胞亚群的免疫表型一般为 Rhodamine123Dull CD34 CD38 HLA DR 和CD34 CD38 HLA DR 两群细胞 前者克隆率为50 能向所有造血细胞系分化 后者除前者功能外 还能形成复杂的 能支持造血前体细胞分化的基质结构 这种细胞被命名为Common hematopoietic stromal StemCell CSC 三色分析又发现 Osawa等人首先证明小鼠HSCs可以是CD34阴性的 人的CD34阴性细胞也有低水平的造血能力 移植研究表明胎绵羊CD34阴性细胞有重新繁殖的能力 人和鼠的CD34阳性细胞可能来源于CD34阴性细胞 CD34是HSCs标志物近年受到的挑战 这些报告提示 HSCs可能是CD34 或CD34 只选择表达CD34的细胞可能导致将更原始的干细胞排除在外 然而几乎所有的临床和实验流程包括体外培养 基因疗法和HSC抑制 目前都设计成收集富含CD34 的细胞 二 干细胞其它免疫表型 从前T细胞杂交瘤中得到的几株单抗 由此单抗识别的抗原被命名为Sca 1 是18kDa磷脂酰肌醇锚定蛋白 属Ly 6抗原家族成员 43Sca 1被广泛认为和Ly 6半抗原一起 是小鼠HSC标志分子 在多能HSCs上表达 1 Stemcellantigen 1 Sca 1 抗Sca 1抗体经常和一些细胞表面标志分子联用一起用来鉴定和分离小鼠HSCs Sca 1 HSCs可在成年骨髓 胎儿肝脏 成年动物外周血和脾脏中被找到 Sca 1在几种非造血组织中也被发现 43Sca 1可用来富集HSCs之外的祖细胞 Sca 1可能参与调节B细胞和T细胞活化 根据Sca 1是否阴性可将Thy 1lowLin 细胞进一步分为 Thy 1lowLin Sca 1 和Thy 1lowLin Sca 1 两群 前者含干细胞和CFU T 后者不含CFU T 两群细胞都含CFU s mouse和rat骨髓造血干细胞中与淋巴系组细胞定向 分化有关的抗原 2 Thy 1 CD90 一种原癌基因 最近证明造血干细胞与c kit基因密切相关 c kit可编码一种穿膜酪氨酸激酶受体分子 应用单克隆抗体证明此分子可存在于造血干细胞膜上 其后证明它的配体分子是造血干细胞因子 stemcellfactor SCF 一种信号传导分子 对造血干细胞的分化具有重要作用 3 c kit CD117 c kit分子可高频率表达于多能干细胞表面 但骨髓中c kit 细胞可分化为各种血细胞 而胸腺中c kit细胞可分化为淋巴细胞 不能分化为髓系细胞 所以胸腺内c kit 细胞 可能是淋巴样干细胞 Lineagenegative 指T B M G 细胞 4 Lin 97kDa的糖蛋白 包括5个跨膜结构域 糖基化后在蛋白胶上显示120kDa的蛋白带 最初是通过AC133单抗鉴定的 它能识别人HSCs的CD34 亚类29 30 一种CD133异构体AC133 2 最近已经被克隆并鉴定为可被AC133抗体识别的原始表面抗原 5 CD133 AC133 ChromosomalLocation 4p16 2 p12 human TheAC133antigenislikelytocontain5 TMdomainsinadditiontoasignalpeptide The5 TMstructureincludesanextracellularN terminus twoshortintracellularloops twolargeextracellularloopsandanintracellularC terminus ProteinSequence hematopoieticstemandprogenitorcells neuralandembryonicstemcells someleukemiasandbraintumoursthatmaybederivedfromstemcells Lowlevelexpressioncouldalsobedetectedinthekidney pancreas placenta andfetalliver Expression MACS isolatedCD133 cellsbecameadherentandCD133 duringcultivation butgaverisetonon adherentCD133 cellsbuddingfromtheadherentcellsurfacebyasymmetriccelldivision CellswerestainedwithCD133 1 AC133 PE Treeofdifferentiation 6 ABCG2 ATP bindingcassette sub familyG member2 Synonyms ABC15 ABCP BCRP BCRP1 BMDP Breastcancerresistanceprotein EST157481 MRX MXR MXR1 Placenta specificATP bindingcassettetransporter 二 造血干细胞的分离纯化 1 FluorescenceActivatedCellSorting FACS 1 组成 细胞计数 数据收集 结果处理 光源 液流 2 基本原理 Flowcell 液体 cell 液鞘 单细 胞液柱 激光激发 数据处理 样本 气压 定量分析 3 非标记分析 根据光散射特性 FACS利用前向光散射 FLS 区别细胞大小 利用垂直光散射 PerpendicularLightScatter 观察细胞的形态和结构 用上述方法分离细胞称非标记分离 4 标记分离 利用被分离细胞表面的一些抗原或受体与相应配体结合 用激光激发结合配体上的萤光 分析不同标记物的光谱 对细胞进行分离 2 avidin biotin亲合分离 细胞用biotin化的抗CD34抗体标记 avidin化的polycrylamidebead柱 CD34阳性细胞挂在柱上 机械振摇 冲洗柱床 收获细胞 一根商品化的分离柱 CEPRATM 一次可收获50 x109个CD34细胞 分离细胞CD34阳性率为67 占整个分离细胞阳性率的51 整个分离过程约需二小时 94年前的产品 3 MegneticActivatedCellSorting 上述方法花费大 之后发展了一种iron dextran系统 细胞 dextran iron 磁场吸附 去掉未吸附细胞 去掉磁场收获感兴趣的细胞 该法特异性较差 分离率不高 聚苯乙烯包被的微球法 细胞与抗CD34抗体孵育 与二抗 包被的微球孵育 启动磁场 到掉未结合细胞 去掉磁场 蛋白水解酶消化 收获细胞 Magneticlabeling Magneticseparation Elutionofthenon Labeledcellfraction ElutionoftheLabeledcellfraction MiniMACS SeparatorBasicforthelab MiniMACSSeparatorwithMSColumn autoMACS SeparatorAutomatedbench topmagneticcellsorterforhighcellnumbersormultiplesamples CliniMACS plusInstrumentCliniMACSallowslargecellnumberstobeseparatedinaclosedandsterilesystem 方法评价 属间接法 分离细胞纯度达90 以上 回收率约为67 由于去掉磁珠时使用了蛋白酶 对细胞其它表面分子有一定破坏作用 该法分离细胞表型完整性尚不十分清楚 直接法 抗CD34 CD38等抗体吸附在直径不同的磁珠上 细胞与之孵育 开启磁场 表面抗原阳性的细胞被吸附 去掉未吸附细胞