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台州市科技计划项目申请表项目名称：姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的影响项目类别：重点科研项目申请单位：浙江省台州医院路桥院区 （盖章）申请日期：2011年4月 3日台州市科技局二六年制台州市科技计划项目申请表一、项目情况项目名称姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的影响项目类别1项目行业分类3项目技术来源1开始日期2011年6月完成日期2012年12月项目经费预算（万元）总计其他3.0自筹银行贷款向市科技局申请部门配套其他1.01.01.0项目经费开支预算（万元）设备费能 源材料费试 验外协费资 料印刷费会议及调研费0.0500租赁费鉴 定验收费人员经费管理费其他费用050.30预计经济效益年增产值（万元）年增利润（万元）年增税金（万元）年创汇（万美元）年节汇（万美元）预计其他成果论文数专利其中发明专利4-5篇说明：项 目 类 别：1、科研 2、新产品 3、推广 4、星火 5、专项 6、软科学项目行业分类：1、工业 2、农业 3、社会发展技 术 来 源：1、自有技术 2、产学研联合开发技术 3、国内其他单位技术 4、引进技术本企业消化创新 5、国外技术二、承担单位第一申请单位单位名称浙江省台州医院路桥院区 详细地址台州市路桥区下里桥路1号单位类型事业单位联系人罗利飞联系电政编码318050开户银行路桥工行银行帐号6222001207100874928主管部门台州市卫生局其他合作单位序号单位名称职责1台州市第一人民医院22345678说明：职责：1、承担，2、参加三、项目负责人及项目组成员项 目负责人姓 名罗利飞联系电-身份证号 历本科学位学士专业技术职务主管技师专业医学检验在本项目中的分工项目负责工作单位浙江省台州医院路桥院区项目组成 员序号姓 名出生年月专业技术职务工作单位在本项目中分工1凌杰1976.5主管技师台州市第一人民医院项目设计2汪官富1966.10副主任医师台州医院实验指导3陆如岳1975.5副主任技师台州医院实验测定4韩子华1975.3主治医师台州医院标本收集5童静玲1976.10主管药师台州医院分析指导四、主要研究内容和要达到的主要技术、经济指标主要研究内容：l应用胶原酶消化法分离获得子宫肌瘤细胞并体外培养。通过免疫组化的方法鉴定培养的细胞为子宫肌瘤细胞。观察姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖的影响：10、20、40 u molL姜黄素分别处理子宫肌瘤细胞24h后，应用MTT比色法检测不同浓度姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖能力的影响2. 研究姜黄素对子宫肌瘤细胞诱导凋亡的作用：光镜观察对照组和实验组子宫肌瘤细胞的生长情况、形态学改变，原位末端TdT酶标记技术(TUNEL)检测姜黄袭诱导子宫肌瘤细胞凋亡的作用。3. 探讨姜黄索诱导子宫肌瘤细胞凋亡的分子机制：采用逆转录一聚合酶链反应(RTPCR)及蛋白质印迹法，检测姜黄素对子宫肌瘤细胞Transgelin基因mRNA及蛋白的表达的情况。为子宫肌瘤的临床诊断和治疗提供新的思路和依据。要达到的主要技术和经济指标：1 应用胶原酶消化法分离获得子宫肌瘤细胞并体外培养。（通过免疫组化的方法鉴定培养的细胞为子宫肌瘤细胞。）2 发现姜黄素对子宫肌瘤细胞的生长发展有明显的抑制作用，且随药物浓度的升高该抑制作用明显增强，呈剂量依赖性；且子宫肌瘤细胞Transgelin基因mRNA及蛋白的表达增加，这种作用可能通过调控Transgelin基因mRNA及蛋白表达作为机制之一来发挥作用的；姜黄素有治疗子宫肌瘤的潜能。3 通过本研究为姜黄素等中药成分的抗肿瘤机理研究提供一个新的途径，同时为姜黄素的临床应用提供科学的理论依据。4 通过本研究为子宫肌瘤的临床诊断和治疗提供新的思路和依据，具有潜在的经济和社会效益。5 拟SCI收录或发表中华级论文35篇。（以上内容的简要说明，字数250字左右，此栏必填。）本研究应用胶原酶消化法分离获得子宫肌瘤细胞并体外培养。观察姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖的影响：10、20、40 u molL姜黄素分别处理子宫肌瘤细胞24h后，应用MTT比色法检测不同浓度姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖能力的影响。检测姜黄素对子宫肌瘤细胞Transgelin基因mRNA及蛋白的表达的情况。了解姜黄素是否有治疗子宫肌瘤的潜能。以期为子宫肌瘤的临床诊断和治疗提供新的思路和依据。五、计划进度目标起始年月进度目标要求（每栏限80字）2011年6月-2011年9月收集相关临床资料和标本，分离获得子宫肌瘤细胞并体外培养。2011年9月-2012年6月观察姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖的影响，检测姜黄素对子宫肌瘤细胞的影响下Transgelin基因mRNA及蛋白的表达情况。2012年6月-2012年12月总结分析实验结果，撰写课题论文，课题鉴定六、审查意见县（市、区）科技局或市级主管部门审查意见：负责人签字：2011年4月18日单位（盖章）台州市科技局审查意见：负责人签字：2011年3月18日单位（盖章）台州市科技计划项目可行性报告项目名称：姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的影响项目类别：重点科研项目申请单位：浙江省台州医院路桥院区 （盖章）申请日期：2011年 4月 17 日台州市科技局二六年制一、 立项的背景和意义子宫平滑肌瘤(Uterine leiomyoma)又称纤维肌瘤(Fibromyoma)，是女性生殖器官中最常见的良性肿瘤，由子宫平滑肌组织增生而成，是多个因素联合作用的结果，其确切的病因和发病机制目前尚未明确1-2。子宫肌瘤因生长部位、数目和大小不同可见不同的症状，如腹部包块、子宫异常出血、下腹痛、不孕、流产、邻近器官压迫症状等，有23肌瘤患者可没有明显症状，往往是通过体检偶尔发现3，子宫肌瘤也是导致子宫切除的主要原因之一。给患者带来了严重的身心健康影响。近年来的研究发现，从子宫肌层细胞到肌瘤形成的过程是多因素，多步骤的，涉及正常子宫肌层的体细胞突变，性激素及生长因子间复杂的相互作用4-7，如：基因编码位于细胞染色体断裂点的簇集区的HMGIC的异常表达8,9；应用促性腺激素释放激素激动剂(gonadotrophin releasing hormone agonist，GnRHa)抑制机体的雌孕激素水平后，肌瘤的形态为细胞收缩和失去胶原纤维结构，也未观察到明显的细胞结构的破坏。停用GnRHa后，下丘脑一垂体一卵巢轴的功能恢复，肌瘤反弹10，说明肌瘤的形成并非单纯由卵巢激素决定，是和多种细胞因子等综合因素共同作用的结果。Transgelin基因作为具有转型变异及形状改变敏感性的肌动蛋白凝胶蛋白被首次发现，被认为是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)的标志基因，广泛存在于鸡和哺乳动物平滑肌组织中，并且其定位于细胞骨架结构。Transgelin基因被认为与子宫肌瘤的发生、发展有关11。 姜黄素（curcumin,Cur）是从姜黄、郁金和莪术等植物的根茎中提取的一种酚类色素，现已有纯度高达 99姜黄素作为成品化合物出售。几个世纪以来，一直被用作食物调料的姜、咖喱和芥末里均含有姜黄素，在传统医药里，姜黄素常常被用来治疗炎症性疾病12。姜黄素毒性小，能有效的治疗胃炎和溃疡，还具有抗肿瘤的潜能，能够抑制化学物质诱导的皮肤癌、食管癌和十二指肠癌13,14。近年来多应用于抗肿瘤研究。其抗肿瘤机制包括：清除氧自由基、抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等，有学者研究证实姜黄素体外实验可以干预IGF-1 相关信号通路，抑制肿瘤细胞生长，促使肿瘤细胞凋亡15。天然药物成分越来越多地提取纯化用于攻克肿瘤，病毒性疾病（乙肝、艾滋病等）等各种难治性疾病。新的研究也让传统医药再次焕发魅力，对中草药的有效成份的提取方兴未艾，激起了学者们极大的兴趣。姜黄素便是其中一个例证，不仅能够抗氧化减少自由基，减轻炎症病变、促使肿瘤细胞凋亡和抑制血管生长。但姜黄素对子宫肌瘤的影响及机制研究未见报道，姜黄素是否可以用来治疗子宫肌瘤，能否抑制子宫肌瘤发生发展癌变,机制如何？值得我们探索研究。本实验应用胶原酶消化法分离获得子宫肌瘤细胞并体外培养。通过免疫组化方法鉴定培养的细胞为子宫肌瘤细胞。观察姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖的影响：10、20、40umolL姜黄素分别处理子宫肌瘤细胞24h后，应用MTT比色法检测不同浓度姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖能力的影响光镜观察对照组和实验组子宫肌瘤细胞的生长情况、形态学改变，原位末端TdT酶标记技术(TUNEL)检测姜黄袭诱导子宫肌瘤细胞凋亡的作用。采用逆转录一聚合酶链反应(RTPCR)及蛋白质印迹法，检测姜黄素对子宫肌瘤细胞Transgelin基因mRNA及蛋白的表达的情。以期为子宫肌瘤的临床诊断和治疗提供新的思路和依据。二、 国内外研究现状和发展趋势（包括国内外研究现状分析、当前需要解决的主要问题等） 子宫平滑肌瘤是女性生殖器官中最常见的良性肿瘤，发病率高，有的严重影响妇女的身心健康。子宫肌瘤的发病机理以及发生发展的分子生物学机制现在尚不清楚。目前认为从子宫肌层细胞到肌瘤形成的转化过程可能涉及正常子宫肌层的体细胞突变，性激素及生长因子间复杂的相互作用。长期以来，在子宫肌瘤的发生机制的研究中，雌激素一直被认为是子宫肌瘤发生和发展的促进剂16,17。且目前对子宫肌瘤的治疗中西药治疗均未取得满意疗效，手术切除子宫是最终采用的主要手段，但由此给女性身心健康带来诸多不良影响。姜黄素(curcumin)是从我国传统中药姜黄根茎中提取的一种植物多酚。现代药理学研究表明，姜黄素具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤等多方面的药理作用，体外实验及动物实验证实，姜黄素可以在多个靶点抑制肿瘤细胞的生长和繁殖，抑制大鼠皮肤癌、胃癌、十二指肠癌、结肠癌及乳腺癌等的发生。目前研究认为其抗肿瘤可能涉及诱发肿瘤细胞凋亡、阻断肿瘤细胞信号传导通路、抗氧化和抑制肿瘤血管生成等方面。但由于肿瘤的发生是一个多因素、多基因相关的复杂过程，姜黄素的抗肿瘤机制研究有待进一步深入。姜黄素在日常食用的调料姜、咖喱和芥末中就含有大量姜黄素，姜黄素能够抗氧化减少自由基，减轻炎症病变、促使肿瘤细胞凋亡和抑制血管生长等作用。其更大的好处在于毒副作用小，一般剂量的姜黄素的摄入，对生物体没有任何毒病学调查发现，经常食用咖喱的人的乳腺癌淋巴转移率要明显低于不食用咖喱者，常食用咖喱的人患肿瘤的机率也较不食用咖喱的人要低。在当前天然药物成分越来越多地提取纯化用于攻克肿瘤，病毒性疾病（乙肝、艾滋病等）等各种难治性疾病。新的研究也让传统医药再次焕发魅力，对中草药的有效成份的提取方兴未艾，激起了学者们极大的兴趣。姜黄素不仅能够抗氧化减少自由基，减轻炎症病变、促使肿瘤细胞凋亡和抑制子宫肌瘤的预后。同时也给了我们一些新的启发，适当调整我们的饮食习惯，如食用姜、咖喱和芥末等，能很好在日常生活中起到预防肿瘤作用，甚至是用食物疗法来替代或是减轻给病人带来巨大负担和创伤的手术、放疗和化疗等，是值得探索的。本研究应用胶原酶消化法分离获得子宫肌瘤细胞并体外培养，通过免疫组化的方法鉴定培养的细胞为子宫肌瘤细胞。观察姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖的影响：10、20、40umolL姜黄素分别处理子宫肌瘤细胞24h后，应用MTT比色法检测不同浓度姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖能力的影响；研究姜黄素对子宫肌瘤细胞诱导凋亡的作用：光镜观察对照组和实验组子宫肌瘤细胞的生长情况、形态学改变，原位末端TdT酶标记技术(TUNEL)检测姜黄袭诱导子宫肌瘤细胞凋亡的作用； 探讨姜黄索诱导子宫肌瘤细胞凋亡的分子机制：采用逆转录一聚合酶链反应(RTPCR)及蛋白质印迹法，检测姜黄素对子宫肌瘤细胞Transgelin基因mRNA及蛋白的表达的情况。为子宫肌瘤的临床诊断和治疗提供新的思路和依据。参考文献：1. 王玮，许伟，丁淑玉以人群为基础子宫肌瘤危险因素病例对照研究J中华肿瘤防治杂志，2007，14(11)：821-8232. 王卡荣，王敏孙风娟子宫肌瘤组织中胰岛素样生长因子-I和IImRNA表达及意义J中国实用妇科与产科杂志，2005，21(12)：7537543 Strawn EY Jr，Novy MJ，Burry KA，et a1Insulin-like growth factor I promotes leiomyoma cell growth in vitroAm J Obstet Gynecol，1995，172(6)：1837434 Cohen DT，Oliva E，Hahn PF，et a1Uterine smoothmuscle tumors with unusual growth patterns：imaging with pathologic correlationAJR Am J Roentgenol，2007，188(1)：246555 AI-Hendy A，Salama SGene therapy and uterine leiomyoma：a reviewHum Reprod Update，2006，12(4)：3854006 Ohara NSelective estrogen receptor modulator and selective progesterone receptor modulator：therapeutic efficacy in thetreatment of uterine leiomyomaC1in Exp Obstet Gynecol，2005，32(1)：9-117Cook JD，Walker CLThe Eker rat：establishing a genetic paradigm linking renal cell carcinoma and uterine leiomyomaCurr Mol Med，2004，4(8)：813-248 Wisniewski JR，Schwanbeck RHigh mobility group IY：multifunctional chromosomal proteins causally involved in tumor progression and malignant transformation(review)Int J Wol Med2000，6(4)：409199 Borrmann L，Wilkening S，Bullerdiek JThe expression of HMGA genes is regulated by their 3UTROncogene，2001；20(33)：45374110 Englund K，Blanck A，Gustavsson I，et a1Sex steroid receptors in human myometrium and fibroids：change during the menstrual cycle and gonadotropin-releasing hormone treatmentC1in Endocrinol Metab，1998，83：4092-611 刘群，岳阳，王敏子宫肌瘤组织Transgelin基因表达及其临床意义的研究J中华肿瘤防治杂志，2008，15(21)：1655-165812. Surh Y. Molecular mechanisms of chemopreventive effects of selected dietary and medicinal phenolic substances. Mutat Res 1999; 428(1-2):305-27.13. DAcquisto F, Iuvone T, Rombola L, Sautebin L, Di Rosa M, Carnuccio R.Involvement of NF-kappaB in the regulation of cyclooxygenase-2 protein expression in LPS-stimulated J774 macrophages. FEBS Lett 1997; 418(1-2):175-8.14. Amir AS, Shoshana Y, Derek L, et a1The Role of the IGF System in Cancer Growth and Metastasis: Overview and Recent Insights. Endocrine Reviews, 2007, 28(1):20-4715. 夏艳秋，徐永平，金礼吉，张斌，薛宏宇.姜黄素对IGF-1促肿瘤细胞增殖活性的抑制及其对细胞膜上IGF-1R表达的调控研究. 第七届中国生命科学大会，2006，11，昆明16. Fukuhara K，Kariya M，Kita M，et a1Secreted frizzled related protein I is overexpressed in uterine leiomyomas， associated with a high estrogenic environment and unrelated to proliferative activityJ Clin Endocrinol Metab，2002，87(4)：1 7293617. Gao Z，Matsuo H，Nakago S，et a1p53 Tumor suppressor protein content in human uterine leiomyomas and it s down-regulation by 17 beta-est TadiolJ Clin Endocrinol Me-tab,2002,87(8)：391520三、 研究开发内容和技术关键研究内容:l应用胶原酶消化法分离获得子宫肌瘤细胞并体外培养。通过免疫组化的方法鉴定培养的细胞为子宫肌瘤细胞。观察姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖的影响：10、20、40 u molL姜黄素分别处理子宫肌瘤细胞24h后，应用MTT比色法检测不同浓度姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖能力的影响2. 研究姜黄素对子宫肌瘤细胞诱导凋亡的作用：光镜观察对照组和实验组子宫肌瘤细胞的生长情况、形态学改变，原位末端TdT酶标记技术(TUNEL)检测姜黄袭诱导子宫肌瘤细胞凋亡的作用。3. 探讨姜黄索诱导子宫肌瘤细胞凋亡的分子机制：采用逆转录一聚合酶链反应(RTPCR)及蛋白质印迹法，检测姜黄素对子宫肌瘤细胞Transgelin基因mRNA及蛋白的表达的情况影。为子宫肌瘤的临床诊断和治疗提供新的思路和依据。拟解决的关键问题：1 性状稳定的子宫肌瘤细胞体外培养：取子宫肌瘤组织1cm3 , 迅速低温运输至细胞培养室, 剪碎成1 mm3的小块, 胶原酶热消化后, 细胞悬液离心沉淀接种, 细胞附壁单层生长至80%融合状态后进行传代。 每例细胞传23代,光镜下观察肌瘤细胞。2 姜黄素对肌瘤细胞抑制：MTT法、原位末端TdT酶标记技术。3 Transgelin基因mRNA及蛋白的测定：可参考相关RTPCR书集。四、 预期目标（主要技术经济指标、应用或产业化前景）本研究应用胶原酶消化法分离获得子宫肌瘤细胞并体外培养。（通过免疫组化的方法鉴定培养的细胞为子宫肌瘤细胞。）发现姜黄素对子宫肌瘤细胞的生长发展有明显的抑制作用，且随药物浓度的升高该抑制作用明显增强，呈剂量依赖性；且能使子宫肌瘤细胞Transgelin基因mRNA及蛋白的表达增加，这种作用可能通过调控Transgelin基因mRNA及蛋白表达作为机制之一来发挥作用的；姜黄素有治疗子宫肌瘤的潜能。1）子宫肌瘤是女性生殖器官中最常见的良性肿瘤，目前中西药治疗均未取得满意疗效，手术切除子宫是最终采用的主要手段，但由此给女性身心健康带来诸多不良影响。通过本研究为子宫肌瘤的临床诊断和治疗提供新的思路和依据，具有潜在的经济和社会效益。2）通过本研究为姜黄素等中药成分的抗肿瘤机理研究提供一个新的途径，同时为姜黄素的临床应用提供科学的理论依据。3）通过一系列研究有利于阐明子宫肌瘤的病因及发展机制，进一步高子宫肌瘤的早期诊断和预防，可节省医疗费用支出开支。具有重大的社会、经济效益和科学价值。五、项目实施方案、技术路线、组织方式与课题分解研究方法和技术路线：1病例收集：1).应用胶原酶消化法分离获得子宫肌瘤细胞并体外培养。通过免疫组化的方法鉴定培养的细胞为子宫肌瘤细胞。2)观察姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖的影响：10、20、40 u molL姜黄素分别处理子宫肌瘤细胞24h后，应用MTT比色法检测不同浓度姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖能力的影响。3）研究姜黄素对子宫肌瘤细胞诱导凋亡的作用：光镜观察对照组和实验组子宫肌瘤细胞的生长情况、形态学改变，原位末端TdT酶标记技术(TUNEL)检测姜黄袭诱导子宫肌瘤细胞凋亡的作用。4）.Transgelin基因mRNA检测 采用RT-PCR法参照Trizol说明书采取一步法提取总RNA，参照RTPCR试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA，取25UL产物进行PCR反应，最后进行PCR产物电泳及检测。5) Transgelin基因蛋白检测 采用蛋白质印迹法，取20UL蛋白上样进行蛋白免疫印迹实验，以碱性磷酸酶染色液染色，用自动电泳凝胶成像系统分析仪，对免疫印迹条带进行半定量分析。2方法学的建立1).子宫肌瘤细胞株的选择：应用胶原酶消化法分离获得子宫肌瘤细胞并体外培养。通过免疫组化的方法鉴定培养的细胞为子宫肌瘤细胞：RPMI 1640培养液、新生胎牛血清、01胰蛋白酶、002EDTA、二甲基亚砜、台盼兰苏木精、伊红染液选购。2). 姜黄素对子宫肌瘤细胞增殖、诱导凋亡：姜黄素、MTT液选购3). Transgelin基因mRNA检测：逆转录合成cDNA，进行PCR产