流式细胞仪小结.doc

流式细胞仪技术及专利研究新进展(高金湖 无锡荣兴科技有限公司生物化学部)流式细胞术（Flow Cytometer, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。流式细胞仪主要由细胞流动室、激光聚焦区、检测系统、数据处理系统等4 部分组成，其工作原理是将被检测对象如细胞等制备成一定浓度的分散的细胞悬液，经特异性荧光染料染色后放入流式细胞仪的样品管中，细胞在气体的压力下进入流动室、流动室由样品管和鞘液管组成，在鞘液的约束下，细胞排列成单列从流动室的喷嘴高速喷出成为细胞液粒，经特异性荧光染色后的细胞经过激光检测区时受激光激发，产生散射光和荧光信号，通过一些波长选择通透性滤光片，可以将不同波长的散射光和荧光信号区分开来，散射光是从细胞表面或细胞内颗粒散射出来的原激光光谱，其信号比较强，用光敏二级管即可检测。荧光信号较弱，需用光电倍增管接收并放大，散射光和荧光信号接收后经转换成电信号，这些信号经过加工处理储存于计算机中，用专门的计算机软件对其储存的数据进行图像处理，可在计算机上直观地统计出各种染上荧光染料的细胞的百分率，选择不同的单克隆抗体及荧光染料，可同时测定一个细胞上的多种不同的特征如细胞大小、DNA 含量、细胞表面抗源表达、癌基因蛋白等等。市场上销售的流式细胞仪产品种类很多，主要生产厂家有：BD、Beckman-Coulter、Partec、Accuri Cytometers、Guava、Union Biometrica、Amnis等，比较熟悉的还是BD和Beckman Coulter。各个公司仪器的用法会有所不同，但原理是完全一致的。BD公司生产的流式细胞仪都冠以FACs(fluorescence activated cell sorter)，即荧光激活细胞分选器。其型号种类比较齐全，如早期的FACSort、FACS Canto、FACScan。现在市场上供应的型号有五种：FACSCount(小型流式细胞仪)、FACSCalibur(流式细胞仪)、FACSAria(流式细胞分选仪)、FACSVantage SE(多色分析和高速分选流式细胞仪)、LSRII(数字化分析型流式细胞仪)。Beckman公司的流式细胞仪的型号有：EPICS XL/XL-MCL，FC500, CyAn ADP等。下面主要简单介绍下BD公司的流式细胞仪1FACSCalibur.BD FACSCalibur 流式细胞仪是第一台全自动四色流式系统兼具分析和分选双相功能的台式机，偏重于临床，其整体设计帮助临床医生快速实现常规免疫表型、CD4T细胞计数、DNA、网织红细胞、血小板等临床分析，兼具分选功能。配备有二根激光管，可同时检测4个荧光参数。可识别粘联细胞。开机无需等待，预热5分钟即可上机检测。2FACSAriaBD FACSAria流式细胞分选仪为台式高速细胞分选仪，获取速度达70,000细胞/s，分析速度达50,000细胞/s。使用石英杯流动检测池固定光路校准技术。使用三种激光，多色分析，分析参数可达15色。两管或四管分选，可以使用多种规格的收集管。液流监测系统白动监测液流断点，检查堵塞，实现了细胞分选的无人操作。配件BDACDU装置，可以在微孔板或载波片上定量分选细胞。3FACSCanto BD FACSCanto 流式细胞仪是第一台六色分析的台式流式细胞仪，系统兼具流式细胞分析仪BDTMLSR和流式细胞分选仪BD FACSAriaTM上首次使用的许多高新技术；液流控制车的设计节省了时间，提高了效率。BD FACSCanto流式细胞仪适用于各种科研应用，尤其适用于对含量极少的细胞进行高速分析，而且样本间的交叉污染却极小。4FACSVantage FACSVantage具有最佳分析灵活性和高速度分选功能，可通过Autosort进行自动化分选。除常规应用外，还可进行高分辨率的染色体分析。5FACSVantage SETMFACSVantage SETM是在FACSVantage的细胞分选功能基础上推出的分选增强型流式细胞仪。六色荧光分析系统，点对点分选，配置FACS Diva数字化系统，提供全面的配套试剂。速度和功能优于FACSVantage。6FACSAria IIIBD公司近日宣布推出新一代的流式细胞仪BD FACSAria III细胞分选系统，它能够利用6根激光运行复杂的多色实验。自2003年首次推出BD FACSAria以来，这一系列仪器开创了细胞分选的复杂世界，让受众更多，应用范围更广。如今新上市的BD FACSAria III系统更加强大、可靠，且更易用。BD FACSAria III细胞分选系统的创新包括：(1)为了获得更高的灵敏度，BD FACSAria III使用了新一代的石英杯流动检测池。它的专利设计确保激光精确集中在样品束上，这样能产生最大的信号，并收集到最大量的发射光。固定光路校准技术让启动时间最短，无需每日调整光路，仪器随开随用，改善了实验之间的重复性。更重要的是，它还改善了收集效率，并优化了多色应用所需的分辨率，即使是在高速分选设置下。(2)光学系统的创新让信号检测最大化，并大大提高了多色分析中每种颜色的灵敏度与分辨率。灵敏度与分辨率提高意味着即使模糊的细胞群也能轻松鉴定并分选。光学系统允许对多色分析进行优化，以获得更佳的结果。激发和收集光学系统的创新设计减少了激发损失，并显著改善了收集效率，从每个样品中得到更佳的信息。(3)对于很多用户而言，细胞分选器的性能是根据其灵活性来界定的，而灵活性又与可同时检测的参数量有关。BD FACSAria III采用新的可扩展结构，支持6种激光波长：633 nm、561 nm、488 nm、445 nm、405 nm和375 nm，以及最多20个探测器位置，能同时测定18种颜色。(4)向后兼容的结构让用户能升级现有的仪器到最新的BD FACSAria III平台。通过现场升级，拥有BD FACSAria或BD FACSAria II系统的实验室也能享用BD FACSAria III的最新性能。(5)BD FACSAria软件有效控制了BD FACSAria III工作站的设置以及数据的获取和分析。BD FACSAria软件是多个BD 细胞分析仪和细胞分选仪共用的。研究人员享受到应用灵活性，因为很容易将分析设计和优化从一个平台移到另一个平台，比如从分析到分选。以下是BD和Beckman Coulter产品性能的比较：BD（FACSAria）Beckman-Coulter（EPICS ALTRA）激光三激光，波长为488nm，633nm，407nm三激光荧光检测灵敏度125MESF50000个细胞/秒样品分析速度50,000细胞/秒3,0000个细胞/秒回收率 80%95%分选存活率90%90%分选纯度98%99%检测颗粒340m0.3m荧光检测分辨率3.0%2%分析参数15色9色分选精度1/32液滴100ul分选通道两路或四路分选2个特有使用石英杯流动检测池固定光路校准技术同时配备空冷激光和水冷激光，可以方便的满足分析和紫外和高功率激光的分选工作近年来，流式细胞仪技术迅速发展，应用日趋广泛，其主要技术趋势有：1 多激光，多色分析在临床上，流式细胞仪的发展经由了最早的双色荧光分析，到三色荧光分析，到现在的四色荧光分析流式细胞仪。目前临床上广泛使用的是单激光三色或双激光四色分析流式细胞仪。近年，为了使样本一次检测更多结果，满足临床多色分析诊断的需要，一些厂家为临床应用专门设计了六色分析流式细胞仪，如BD公司的FACSCanto，这一新型流式细胞仪安装固定校准的双激光，可同时作六荧光分析。为了增加检测参数而不影响检测灵敏度，仪器采用了新型光路信号收集检测技术，利用光反射大于光透射的原理，被接收的荧光信号经过一系列双色性反射镜，几种不同波长的荧光信号经过几次反射，被分离开来，光路信号收集系统收集检测反射光信号，而被检测的信号透过反射镜，由相应荧光检测器接收。这样，在增加荧光检测器的同时，大大提高了信号检测灵敏度。BD推出Canto型后发现有一些小毛病，随后又推出Canto II型，2007年开始上市的最新型号，号称世界上检测精度最高。另外，经典的Calibur使用的是苹果系统软件，不熟悉的人很难快速上手，而 Canto II型使用的是Windows系统软件，可能会符合更多人的操作习惯。测量过后软件编辑功能远大于Canlibur。2新荧光染料的开发由于多色分析的需要，人们发现了更多的不同激光激发的不同波长的荧光染料。如紫外光激发的Pacific Blue，Alexa Fluora 405；蓝光激发的Alexa Fluora 488；红光激发的Alexa Fluora 647等。另外，为了使用一个激光器，同时检测更长波长的荧光信号，还使用荧光耦连物，如PE-Cy5，Cy5为吲哚双羰花青衍生物，最大吸收峰为640nm，单独使用时可被红光激发，在安装488nm激光的流式细胞以上，PE被激发光激发，其发射的红光能量被传递给Cy5，仪器上检测到的信号是Cy5发射的红光。这类荧光染料还有PE-Cy7，APC-Cy7，PerCP-Cy5.5等。2 电子系统数字化近两年，流式细胞仪开始由模拟信号系统向数字化信号系统转变，如BD公司的FACSAria、FACSCanto、LSRII等都是数字化系统。在检测中，数字化电子系统连续取样，将信号以数字形式直接保存在存储器内，再将数字转换为相应参数值。这样一来，就使得检测速度更快，信号采集速度可达每个脉冲10,000,000次/秒。有了数字化电子系统，就可以测定任意信号的脉冲高度、宽度和面积，荧光间补偿的调整也更加简单，可以自由进行激光内和激光间的荧光补偿，并可以脱机补偿。以下是BD公司以及国内近年来申请的专利情况1. High throughput flow cytometer operation with data quality assessment and control (高通量流式细胞仪数据质量评估及控制操作 US2009043752)The invention provides a flow system and method for reliable multiparameter data acquisition and particle sorting. In accordance with the invention, a flow system assesses changes in the pattern of data collected in successive time intervals and actuates one or more corrective actions whenever the changes exceed predetermined limits. The present invention overcomes problems associated with collecting data and sorting and enumerating particles in flow cytometry systems that operate for prolonged periods or that must accommodate samples that vary widely in quality .本发明提供了可靠的多参数数据采集和粒子排序的流式系统和方法。本发明中，该流式系统可评估在连续的时间间隔内收集的数据变化的模式，并可在任何超过预先限度的情况下驱动一个或多个纠正口令。在流式细胞仪系统长时间运行或适应样品质量大幅变动时，本发明可克服机器数据收集，整理和列举的相关问题。2Multiplex microparticle system (多重微粒系统US2009163378) Arrays of microparticle populations, each population labeled with a single fluorescent dye, are provided for use in multiplex assays. The populations form a virtual multidimensional array wherein each microparticle is identified by fluorescence intensity in two different fluorescence detection channels. The arrays are useful in a variety of assays, including multiplex, multi-analyte assays for the simultaneous detection of two or more analytes by, for example, flow cytometry, and a labeling reagents in, for example, microscopy. The use of singly-dyed microparticles to form multidimensional arrays greatly simplifies the creation of multiplex assays.每个微粒都以单个荧光染料标记的微粒群展示，可在多重检测分析中使用。微粒群形成一个虚拟多维数组，其中每个微粒是根据两种不同的荧光检测通道由荧光强度进行确定。这些阵列在多样分析中非常有用，包括以多重、多分析物分析法对两个或多个分析物进行同时检测，例如流式细胞仪和显微镜的标签试剂。使用单染微粒以形成多维数分析，大大简化了多重检测的分析工作。3Instrument and methods for analysing a multiplicity of fluorescent dyes using a multiplicity of photodetectors having adjustable gains (用多重光电检测器分析荧光染料多样性的仪器和方法的调整US2004119974)An instrument for analysing a multiplicity of fluorescent dyes is disclosed, said instrument comprising a multiplicity of photodetectors, each having an adjustable gain, and a stored representation of pairwise functional relationships between measured fluorescence and photodetector gain for each of said photodetectors and for each of said fluorescent dyes. Preferably, the instrument is a flow cytometer. Furthermore, methods are disclosed for calculating compensation/quantitation for arbitrary sets of photodetector gain settings which do not require the analysis of additional setup samples.一种用于分析仪器的荧光染料的多重披露说，仪器的探测器组成的多样性，每个有一个可调增益，并测量了荧光和光探测器之间的成对获得存储在每个功能关系的代表表示，每个探测器，并表示荧光染料。最好的工具是流式细胞仪。此外，计算方法是公开补偿/增益设置的探测器任意设置哪些不需要额外的设置样品定量分析。4Prism-based flow cytometry excitation optics (棱镜型流式细胞仪激发光 US20040061853)A prism-based cytometry excitation optics system redirects, shapes and combines plural beams provided by light sources, so they can be focused by an objective into closely spaced spots within the channel of a cytometry flow cell. The mounted set of dispersive prisms redirect beams of different wavelengths so that beams with separated inputs emerge from the final prism, substantially overlapping in position and nearly parallel to one another. Preferred embodiments having a mounted set of four distinct isosceles triangular prisms are described with particular orientations and positions, but the specific design parameters may vary depending on the choice of beam wavelengths, spot separations in the flow cell, and choice of prism material. The prism system has inherently better thermal and long-term stability compared to mirror-based optics.一个棱镜的光学系统流式细胞仪激发重定向，结合复数光束形状和所提供的光源，因此他们可以集中到密点，由客观的流式细胞仪内的一流通池通道。装入的色散棱镜的重定向设置不同波长的光束，使分离的投入与最终摆脱棱镜，大大重叠的位置上，彼此几乎平行光束。首选体现安装一套有四个三角形棱镜方向和立场，并特别介绍不同的等腰三角形，但具体的设计参数可能会有所不同波长的光束，在流动细胞分离点的选择，和棱镜材料的选择。棱镜系统具有更好的热性能和内在的长期稳定相比，镜面的光学系统。5Flow cytometry lens system(流式细胞仪镜头系统US0225575)A flow cytometry lens system features a low (1.55) refractive index, near hemispheric plano-convex lens nearest a cytometry flow cell with the planar surface (4) on the object side of the system and a convex surface (5) with a radius of curvature in a range from 3.5 to 5.5mm, followed by a pair of positive meniscus lenses having the concave sides (6,7,8,9) facing the object side , with the surfaces of the second meniscus (8,9) lens less sharply curved than the corresponding surfaces of the first meniscus (6,7) lens which in turn is followed by a positive doublet lens. The lens elements are optimized for providing a working distance of at least 1.75mm, a field of view of at least 400, a numerical aperture of at least 1.19 and a lens magnification in excess of 10.流式细胞镜头系统具有低“（1.55）折射率，近半球平凸最近与平面的表面（4）对系统对象的一面和凹凸面（5）流动池半径流式细胞仪镜头曲率在从3.5到5.5mm的范围内由双方具有积极的半月板凹镜片对面向对象方（6,7,8,9），其次，与第二半月板（8,9）镜头表面，大幅减少弯曲比第一次半月板（6,7）镜头而这又是一个积极的双重镜头跟着相应的表面。经过优化的镜片提供至少一点七五毫米工作距离，至少有一个400A，至少1.19数值孔径，并在超过10镜头放大视野。6OPTICAL ELEMENT FOR FLOW CYTOMETRY(流式细胞仪的光学元件US0041151)An optical element for use in a flow cytometer is provided that comprises a base member having a portion defining a flow channel, and an aspheric concave reflective surface having an optical axis intersecting the flow channel. Some light scattered or emitted by cells or other particulate material in a sample stream passing through the flow channel is collected and reflected by the aspheric concave reflective surface to form an image at an image plane external to the optical element.一种在流式细胞仪使用的光学元件是提供一个基础，包含有部分成员定义一个流道和一个非球面凹面反射面有一流道相交的光轴。有些光散射或由细胞或其他微粒样品中直通的流道通过流物质排放的收集和非球面凹面反射表面反射形成的图像平面在外部的光学元件的图像。7一种基于微流控芯片的流式细胞仪 (宁波普赛微流科技有限公司CN200910273037.0)本发明公开了一种基于微流控芯片的流式细胞仪，涉及一种生物医学检测的流式细胞仪。本发明的结构是：细胞进样单元(10)、激光诱导荧光检测单元(30)和光信号检测和处理单元(50)分别与细胞分选芯片单元(20)连接；细胞分选芯片单元(20)和侧向和前向散射光检测单元(40)连接；激光诱导荧光检测单元(30)和侧向和前向散射光检测单元(40)分别与光信号检测和处理单元(50)连接。本发明与商用的流式细胞仪相比，具有以下优点和积极效果：集成度高、操作方便、体积小、高通量、灵敏度高、速度快、微型化、专用化、分选力多样化，适合个性化流式细胞分析。 8具有细胞分级分离处理功能的流式细胞仪以及活细胞分级分离处理方法(三井造船株式会社 CN200880006269.3)一种具有细胞分级分离处理功能的流式细胞仪和活细胞分级分离处理方法，其中，朝向含有活细胞群的样品液流照射测量用激光，接受测量用激光的照射，分别获取由样品液流的各个活细胞分别所发出的散射光和荧光中的至少一种光信息，根据所获取