一株产紫杉醇云南红豆杉内生真菌分离和筛选.doc

一株产紫杉醇云南红豆杉内生真菌分离和筛选一440一江苏农业科学2010年第5期郑法新,程璐,李侠,等.一株产紫杉醇云南红豆杉内生真菌分离和筛选J.江苏农业科学,2olo(5):440443一株产紫杉醇云南红豆杉内生真菌分离和筛选郑法新,程璐,李侠,王锋(日照职业技术学院,山东日照276826)摘要:紫杉醇是临床上所用的非常重要的天然抗癌药物.从云南丽江塔城地区分离的云南红豆杉中采用无菌技术分离得到110株内生真菌,经过PDA液体培养基发酵后用TLC,紫外分光光度法,HPLC,质谱等方法检测,发现其中有1株的胞外分泌物中含有紫杉醇,标记为G7一B1.经过形态学鉴别,属于拟盘多毛孢属(Pestalotiopsissp.),紫杉醇产率为360.75g/L.该种菌具有进一步研究的价值.关键词:云南红豆杉;内生真菌;紫杉醇;分离;筛选中图分类号:Q939.1l文献标志码:A文章编号:10021302(2010)05044004紫杉烷类化合物是从红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)植物中分离得到的二萜类化合物的总称,其中以抗癌新药紫杉醇最为引人注目.红豆杉是我国珍稀濒危植物,现在的紫杉醇主要是从其树皮中提取.自1992年美国FDA正式批准紫杉醇用于治疗晚期癌症以来,过度砍伐红豆杉现象日益严重.紫杉醇在红豆杉中含量很低,红豆杉资源又有限,而工业提取紫杉醇存在着严重的资源浪费现象.内生真菌作为新的用于生物控制的生物活性物质来源已经越来越引起科学家的重视.Stierle等首次报道了从太平洋紫杉树中分离出一种可产紫杉醇的内生真菌,为人们提供了一个可能生产紫杉醇的新途径,从此国际上兴起了内生真菌产紫杉醇研究的高潮.紫杉醇产生菌种十分多样,Strobel等从西藏红豆杉枝条上分离到一株小孢拟盘多毛孢;周东坡等从东北红豆杉的树皮中分离筛选出一株树状多节孢;邱德有等从云南红豆杉(Taxus),Mnnm如)中分离了一株能产紫杉醇的内生真菌,但是产率很低l_j.微生物发酵生产紫杉醇具有真菌生长迅速,易于培养,所用培养基成本相对较低等许多优点.可以通过优化发酵条件,利用生物技术改良菌种,大幅度提高紫杉醇产量,满足市场需求,可在降低紫杉醇价格的同时减少资源浪费.1材料与方法1.1材料红豆杉树皮和枝条于2008年9月初采自生长在云南丽江塔城地区的云南红豆杉.1.2试剂紫杉醇标准品购于Sigma公司,链霉素购自山东省日照市结核病防治研究所,甲醇(色谱纯)购自上海国药公司,其余试剂如乙酸乙酯,三氯甲烷等各种试剂均为国产分析纯.1.3培养基固体培养基选用PDA培养基:马铃薯200g,葡萄糖2Og,琼脂粉5g,蒸馏水1000mL,pH值自然;121灭菌收稿13期:20100728基金项目:山东省中青年科学家科研奖励基金(编号:2007BS02010).作者简介:郑法新(1975一),男,山东即墨人,博士,讲师,从事微生物生物技术研究.Email:faxinzheng163.COITI.20min,冷却至506O加入25mg/L链霉素.液体培养基选用PDA培养基不加琼脂.1.4内生真菌分离及空白试验将云南红豆杉的树皮和枝条切成约1.5cm的小段,分别经75%乙醇消毒10min和0.1%HgCI溶液处理15min,然后用无菌水冲洗,接种于含链霉素的PDA固体培养基平皿上,置于27恒温箱中培养,待长出菌落后,按无菌操作程序挑出,在PDA斜面培养基上纯化3次以上,将纯化后保存在PDA斜面培养基上的菌株放人冰箱中4保存备用.对照试验:把空白平板打开,摆在超净台上10min,将上述同样表面消毒过的材料不做任何切割,直接种植于PDA平皿上,相同条件下培养.1.5菌种鉴定从纯化培养数日的菌落上挑取菌丝并连同分生孢子制成玻片,置于光学显微镜下观察菌丝形态,孢子梗形态,孢子形态以及孢子与营养体之间的着生关系,查阅有关资料确定真菌的分类学地位”.1.6提取产物的检测1.6.1菌株的发酵培养将分离纯化后得到的真菌菌株进行摇床液体扩大培养,用制备的无菌PDA液体培养基将真菌菌丝体和孢子洗下接人250mL三角瓶,27200r/rain培养3d作种子培养基.种子培养基再接人lL摇瓶扩大培养12d,每种菌保证初始液体培养基为1L.1.6.2发酵产物的萃取把菌体发酵液反复冻融2次,过滤发酵液得滤液上清液,旋转蒸发上清液约剩余1/10,大约剩2025mL上清.倒入等体积的乙酸乙酯,搅拌混匀,用膜封口,冰箱中4萃取12h,分离有机相,萃取2次,收集有机相.有机相35下减压浓缩,除去有机相后加5mL甲醇(色谱纯)溶解,再旋转蒸发至0.5mL,用移液枪取出放在EP管中,4保存于棕色磨口玻璃瓶待用.固体菌丝经过捣碎匀浆后加入等体积的乙酸乙酯4萃取12h,收集菌丝浸提液的有机相,再加入等体积的水进行2次萃取,收集菌丝(胞内)和发酵液(胞外)的有机相,35减压浓缩,除去有机相后用甲醇定容储于棕色磨口玻璃瓶中备用.1.6.3TLC检测(1)制备硅胶板:取适量硅胶,加入3倍体积的5%羧甲基纤维素钠水溶液,在研钵中搅拌均匀,倒适量于干净的玻璃板上,颠匀,室温下晾干,干燥箱中102活郑法新等:一株产紫杉醇云南红豆杉内生真菌分离和筛选化30min备用.(2)点样:趁硅胶板微热时点样(在无菌操作台中开风做).先在硅胶板一端1.513111的平行线上取均匀的3个点,中间点紫杉醇标准品2L,两端点样品,每个点510,每个点直径23mm,风干后放在已预饱和的层析缸中薄层层析,展层剂为三氯甲烷一甲醇混合液(体积比为12:1),等到层析前缘距顶端0.5elll时取出,在无菌工作台中晾干.在凝胶成像仪中254nm观察并拍照,记录.1.6.4紫外光谱检测紫杉醇标准样品用甲醇配成1O90g/mL的梯度溶液,绘制标准曲线,然后进行精密度试验,稳定性试验,重复性试验.对经过薄层层析检测,在与对照品紫杉醇.R值相同的位置将硅胶小心刮下,然后用色谱纯甲醇洗脱.取洗脱的供试样品,测定样品在190350nm的紫外吸收值.1.6.5HPLC及MS检测将紫杉醇标准品配制成甲醇溶液备用.将上述样品经22izm微孔滤膜过滤后采用HPLCMS对得到的洗脱液进一步进行定性分析和定量测定.色谱条件:Waters高效液相色谱系统,反相c柱,200lnnlx4.6mm;柱温为室温;流动相为乙腈与水混合物(体积比为45:55);紫外检测仪,检测波长228nm,流速1.0mL/min,样品经过22m滤膜过滤后进样,进样量lO.质谱条件:检测模式为5acn模式,离子极性为Pos(正离子),离子化方式为ESI,离子分子量范围为5230o,检测离子为H和Na,雾化器流量为10L/min,干燥器温度350,CID电压70V,毛细管电压3.0kV.2结果与分析2.1菌株G7一BI的形态特征菌株G7一Bl在PDA培养基上生长迅速,27下培养1d能产生白色菌丝,之后白色菌丝匍匐生长,形态特征见图1.菌落呈圆形,边缘不规则,菌落厚实;菌落基部初期呈白色,边缘有白色气生菌丝;培养基背面为无色到褐色.显微镜下菌丝有隔膜,未见核,菌丝直径24txm不等,菌丝平均长度为12.6I.zm,在隔膜处会有一个类似收缩的效应,因此整个菌丝呈现出藕节状.分生孢子从菌丝细胞长出,有分枝,分生孢子梗直径约为2.42.7Ixm,具横隔,顶端不膨大,有扫帚状分枝(图2).注:r1色菌丝转匀褐色,絮状,生长迅速,基质为褐色(A.正而;B.反面)图1G7.B1菌株的菌落生长状况C.光学显微镜下的分:孢子(400);D.光学显微镜下的分生孢子(1000)图2显微镜G7B1下的分生孢子形态2.2紫杉醇浓度与吸光度标准曲线对紫杉醇标准样品作标准曲线,结果表明,紫杉醇的进样量在0.11.6zg范围内具有良好的线性关系,回归方程为Y=16435.6+18762.3x,相关系数为0.99965(图3).对菌株G7一B1发酵产物作紫外光谱扫描,发现菌株G7一B1的发酵提取物与标准品一样在228nm左右有最大吸收峰,可以初步认为G7一B1菌株的发酵产物中含有与紫杉醇类似的物质(图4).2.01.51.0O.50020406080紫杉醇浓度(tg/mL)一IIII一实测曲线拟合线性曲线图3紫杉醇浓度与吸光度标准曲线一442一江苏农业科学2010年第5期2.3内生真菌发酵物中紫杉醇含量的检测对从云南红豆杉中分离出来的内生真菌菌株G7一B1发酵产物进行高效液相色谱检测(图5,图6),结果发现其能够产生紫杉醇.在相同的高效液相色谱条件下,笔者对多种内生真菌的发酵产物进行了检测.结果表明菌株G7一Bl发酵产物无论是在出峰位置和峰形上,都与标准品相一致.根据3讨论%峰面积可以计算出该菌株的紫杉醇产量为360.75g/L(图6).为了更进一步确认,笔者对菌株G7一B1发酵产物进行了质谱检测,结果如图7所示,可以看出样品和标准品紫杉醇都是以+Na为主,从而进一步确认G7一Bl发酵液含有紫杉醇.图4紫杉醇标准品(A)与G7一BI菌株提取物(B)紫外光谱扫描曲线紫杉lJ.150lJ12l3】4J516J7J8t92(121时间(rain)紫杉醇标准品HPLC的uV检测l772l8l920时问(min)图6G7一B1发酵提取物HPLC的uv检测在对云南红豆杉进行菌种分离的同时,笔者还进行了对照试验,结果显示对照试验均未有菌丝长出,多次重复结果都一致,证明表面消毒是彻底的,从而保证了所分离到的真菌是2743/,z;l;=i:毒2425262728云南红豆杉的内生真菌而不是空气中的或材料表面的附生菌.为了去除污染的细菌,笔者向培养基内加入细菌抑制剂,并尽可能从消6.3133836I32325l50l75200225250275300325350375400425450475500525550575600625650675700725750775800825850875900925950图7菌株G7一B1产生紫杉醇的质谱图上的菌落边缘的菌丝接于新平板上进行分离培养,采用菌丝顶端纯化法逐步纯化.对菌株编号后,转至PDA试管斜面培养基上,28培养箱中培养57d,然后放人冰箱保存.该菌在第l一3天生长最为迅速,以后生长能力逐渐下降.内生真菌菌种随人工培养基上传代次数的增多易发生变异.因此,掌握好菌种培养时间,减少传代次数,做好菌种的分离,复壮与保藏工作,可以防止菌种发生老化和退化.在对菌株G7一B1的发酵产物做TLC检测时,笔者遇到了很多问题.起初,采用商品的薄层层析板,但这种层析板存在的一个共性问题是边缘效应都比较强,以至于不能对发酵液是否能够产生与紫杉醇标准品相同的,值的物质作出正确的判断.后来,采用自制的薄层层析板,基本解决了边缘效应问题,但是有时候仍然存在边缘效应,这主要是看薄层层析板的质量.在做TLC检测得出初步结果后,又做了HPLC分析,进一步表明菌株G7一Bl的发酵产物与标准紫杉醇的保留时间相同,紫杉醇标准品的保留时间为11.15min,而菌株G7一B1发酵产物的保留时间为11.08min,基本上能确认菌株G7一B1的发酵产物中含有类似紫杉醇物质.在样品中加入标准紫杉醇后,样品和标样的峰完全重叠,由此可以进一步判定菌株G7一B1的发酵纯化产物与标准紫杉醇峰为同一物质,并可根据峰面积推算出菌株G7一B1的发酵液中紫杉醇含量为360.75g/L,从产量来看低于u等的报道.为了更进一步验证菌株G7一B1的发酵产物中含有紫杉醇,又对样品进行了质谱检测(图7),结果显示菌株C7一B1的发酵产物含有与紫杉醇标准分子质量相同的M+Na峰,更近一步证明菌株G7一B1的发酵产物中含有紫杉醇.在对所筛选的菌株的发酵产物进行质谱检测时,同样遇到了一些问题.比如,明明有的菌株经过TLC检测,紫外分光光度检测,HPLC检测可以初步确定含有紫杉醇,而在做质谱检测的时候却没有检测到峰.笔者推测有可能是发酵液中的成分比较复杂,其中有些物质影响了发酵产物中紫杉醇的稳定,导致了发酵产物中紫杉醇的降解.对此,笔者特地做了一个检验试验,将新配的紫杉醇标准品与放了多日的标准品紫杉醇同时进行质谱检测,结果显示新配的标准品里面只有与紫杉醇分子量相对应的物质,而放了多目的标准品紫杉醇的质谱数据检测到了巴卡亭,说明紫杉醇的标准品放的时间稍长就有可能降解.在物质成分复杂的发酵液中,不同成分的相互影响更为显着,所以更容易降解,就有可能检测不到.参考文献:1StrobelGA.EndophytesassourcesofbioactiveproductsJ.Mi?cro3esandInfection,2003,5(6):535544.2StierleA,StrobelG,StierleD.TaxolandtaxaneproductionbyTaxo-myceso,.,anendophyticfungusofPacificyewJ.Science,1993,260:214216.3马玉超,赵凯,王世伟,等.产紫杉醇(Taxo1)内生真菌的生物多样性J.菌物研究,2003,1(1):2832.4孙剑秋,朱红标,刘晓兰,等.东北红豆杉内生真菌分离方法的研究J.齐齐啥尔大学,1999,15(3):l317.5StrobelG,YangXs,SearsJ,eta1.TaxolfromPestalotiopsismicrospo-/a,anendophyticfungusofTaxuswallachianaJ.Microbiology,1996,142:435440.6周东坡,平文祥,孙剑秋,等.紫杉醇产生菌分离的研究J.微生物学杂志,2001,21(1):l8一l9,32.7邱德有,黄美娟,方晓华,等.一种云南红豆杉内生