生化论文-双酶共表达不对称合成乙酸乙酯的重组菌株

双酶共表达不对称合成乙酸乙酯的重组菌株摘要：（R）-2-羟基-4-苯基丁酸酯（HPBE）是合成血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂的重要手性中间体。使用重组菌株将2-氧代-4-苯基丁酸乙酯（OPBE）不对称还原为（R）-HPBE可以提供高的对映体选择性。克隆来自枯草芽孢杆菌的羰基还原酶基因（iolS）和葡萄糖脱氢酶（GDH）基因。使用Ni-NTA柱纯化重组IolS，并研究其酶活性。纯化的IolS在pH6.0和30表现出最大活性，并且该酶显示出低于40的良好热稳定性。在含水体系中重组大肠杆菌对OPBE的不对称还原反应，在10 h / L的OPBE作用下，（R）-HPBE的产率在99以上。关键词：羰基还原酶; 葡萄糖脱氢酶; 共表达。前言：血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂被广泛用于治疗高血压，充血性心力衰竭和其他心血管疾病，因为它们可以降低血管紧张素受体（AngII）来控制血压和保护靶器官1。（R）-2-羟基-4-苯基丁酸酯（HPBE）是合成ACE抑制剂的重要手性中间体，如贝那普利，依那普利和赖诺普利2。近年来已报道了用于制备（R）-HPBE的各种方法，包括化学和生物学方法。这两种方法都可以通过两种方式进行：分辨率和综合。化学方法通常涉及多个步骤和大量的有机试剂3。在解决的情况下，理论最大收益率只有504-6。 2-氧代-4-苯基乙酸的微生物还原丁酸（OPBE）到（R）-HPBE已被深入研究。最近十年 与重组全细胞催化剂相比，野生菌株由于其多个胞内羰基还原酶具有可变的或相反的立体特异性而产生相对较低的对映体过量（ee）的（R）-HPBE 7-9。 以前，在我们的实验室中分离出高效的产生羰基还原酶的菌株Candida krusei SW 2026，其催化OPBE对映选择性还原为（R）-HPBE。 在OPBE 20g / L时，ee和产率分别为97.4和82.0。 使用三个色谱柱将羰基还原酶纯化至均一，并对其酶活性进行了研究10,11。 目前关于重组菌株OPBE向（R）-HPBE不对称还原反应的报道很少。 沉等人。（R）-HPBE在1mol / L时有良好的ee和产率（分别为99和100）（ap-接近206g / L）的OPBE，使用重组大肠杆菌菌株以及CgKR2和GDH编码基因。 由于氧化还原需要昂贵的辅因子NAD（P）H过程中，原位辅因子再生对生态系统的重要性，使用重组菌株的工业规模生物转化的规范。共表达系统的使用解决了辅因子再生的问题。 该技术能够在相同的菌株内表达多种异源蛋白质。 广泛用于辅酶再生的葡萄糖脱氢酶（GDH）从NAD（P）+中回收烟酰胺辅酶NAD（P）H 13-15。在本研究中，三种方法被用于构建包含羰基还原酶基因（iolS）的双酶共表达系统和来自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因（gdh）。 该在含水系统中实现了由重组全细胞催化的生物转化。1、 实验1.1、菌株，质粒和化学品表中列出了本研究中使用的菌株和质粒1.限制性内切酶和T4连接酶购自TaKaRa生物技术公司.PCR相关产品购自东升生物科技有限公司。（R）-HPBE和OPBE购自Sigma-Aldrich Chemical Co. NADP+和NADPH购自Sangon Biotech Co.，China。所有其他试剂和溶剂来自当地商业供应商，并且是分析级或生化试剂。1.2、葡萄糖脱氢酶的克隆和表达使用细菌基因组DNA提取试剂盒从枯草芽孢杆菌分离基因组DNA。 基于其核苷酸序列（GenBank No.M12276）设计了两个用于扩增全长gdh的寡核苷酸引物。 这些列于表2中。将扩增的DNA片段连接到pMD18-T中以产生重组质粒pMD18-T-gdh。 DNA测序由Sangon Biotech Co.进行。用Nde I和HindIII双重消化pMD18-T-gdh，然后插入表达载体pET-24a。 将所得质粒pET24a-gdh转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，筛选阳性克隆并通过菌落PCR和限制性内切酶消化进行确认。 当OD600达到0.6时，用0.4 mmol / L IPTG诱导GDH的表达，孵育温度变为25oC诱导蛋白表达。 然后4小时后收获细胞。 蛋白质浓度通过根据标准程序进行的SDS-PAGE分析来确定16。1.3、筛选，克隆和表达羰基还原酶如上所述分离枯草芽孢杆菌和大肠杆菌K12的基因组DNA。CR编码基因ycsN（NP_388296.1），iolS（AL009126.3）和yccK（NC_000964）基因编码的氨基酸序列，来自枯草芽孢杆菌，而ydhF（P76187.2）和yaj0（P77735.2）来自大肠杆菌K12。克隆，表达和分析方法与1.2节中的gdh基因的描述相同。1.4、酶活性分析 通过分光光度法测定脱氢酶和羰基还原酶活性，通过监测340nm和30o下NADPH吸收的增加或减少。GDH反应混合物包含75mmol / L Tris-HCl（pH8.0），2.0mmol / L NADP+，0.1mmol / L葡萄糖和适量的终体积为0.25ml的酶。 CR的反应混合物由100mmol / L组成磷酸盐缓冲液（pH6.0），1.0mmol / L OPBE，5.0mmol / L NADPH和适量的终体积为0.25ml的酶。一个单位的活性定义为催化氧化1所需的酶的量molNADPH每分钟（CR）或每分钟减少1molNADP+（GDH）。用牛血清白蛋白作为标准，用Bradford法测定蛋白质浓度。1.5、OPBE生物还原成（R）-HPBE将含有100mmol / L磷酸钾缓冲液（pH6.0），OPBE（20mmol / L），NAD（P）H（10mmol / L）和适量酶的2.5ml反应混合物在30oC和220转/分钟12小时。 然后离心该混合物，上清液用乙酸乙酯萃取三次，然后用无水MgSO 44干燥以进一步GC分析。1.6、蛋白质纯化收获诱导的重组细胞并悬浮于缓冲液A（20mmol / L磷酸钠，pH7.4，含有500mmol / L NaCl和5mmol / L咪唑）中。 通过超声处理（285W，脉冲1秒，暂停3秒）破坏细胞10分钟。 通过在4oC下以8000g离心15分钟除去细胞碎片，并将上清液送至用缓冲液A平衡的HisTrap-FF粗螯合亲和柱。将结合的酶通过咪唑浓度的梯度梯度洗脱从含有5mmol / L咪唑的缓冲液A到含有1000mmol / L咪唑的相同缓冲液中。 蛋白质样品通过SDS-PAGE分析。1.7、pH和温度对纯化酶的影响通过在10至70o范围内温育确定最佳温度。为了确定最佳pH，在具有各种pH（4.0-10）的100mmol / L缓冲液中测定活性：柠檬酸钠缓冲液（pH4.0-6.0），磷酸钠缓冲液（pH6.0-8.5）和甘氨酸-NaOH缓冲液pH 8.5-10）。 为了热稳定性，将纯化的酶的等分试样在10-60oC的100mmol / L磷酸盐缓冲液（pH6.0）中温育1小时，随后在冰上冷却，然后进行活性测定。在4oC下将纯化的酶在具有不同pH值（4.0-9.0）的相同缓冲液中温育24小时后测定pH稳定性。 所有的活动都在1.4节描述的标准条件下进行测量。1.8、IolS和GDH的共表达为了实现IolS和GDH的高水平表达，本研究尝试了三种共表达策略。 该第一种方法是构建重组质粒pET-G-SD-I（图1）。 使用pET20b-iolS作为模板设计正向引物（SDf）和反向引物（IolSr）进行PCR。 将得到的5末端具有SD序列的片段iolS基因克隆到pET24a-gdh中，得到双酶共表达质粒 pET-G-SD-I。 第二种方法是构建重组质粒pET-G-T7-I（图2）。 使用pET20b-iolS作为模板，设计正向引物（T7f）和反向引物（IolSr）进行PCR。 将得到的具有T7启动子和5端rbs序列的iolS基因片段克隆到pET24a-gdh中，得到双酶共表达质粒pET-G-T7-I。 在第三种方法中，将pET-20b-iolS和pET-24a-gdh都转化到大肠杆菌BL21（DE3）中以产生双质粒系统。 该菌株在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上生长。图一、共表达质粒pET-G-SD-I的结构1.9、表达条件的优化在不同的温度下（15,20,25,30,35和40oC）和不同浓度的不同浓度的大肠杆菌BL21（DE3）/ pET24a-gdh和大肠杆菌BL21（DE3）/ pET20b- IPTG（终浓度为0.2,0.4,0.6,0.8,1.0和1.2mmol / L）。1.10、OPBE生物还原成重组大肠杆菌催化的（R）-HPBE将含有100mmol / L磷酸钾缓冲液（pH6.0），NAD+（0.05mmol / L），葡萄糖（200mmol / L），OPBE（50mmol / L）和2g的湿细胞在30和220r / min温育15小时。 反应后，上清液用乙基萃取三次乙酸乙酯洗涤并经无水MgSO 44干燥用于进一步的GC分析。二、结果与讨论2.1、GDH的克隆，表达及诱导条件的优化序列分析表明gdh（783 bp）编码260个氨基酸。计算的GDH的分子量为28kDa。克隆的gdh与枯草芽孢杆菌gdh（GenBank No.M12276）的核苷酸序列具有98的相似性，与其氨基酸序列具有100的相似性。 图3显示大肠杆菌BL21（DE3）/ pET24a-gdh的无细胞提取物的SDS-PAGE。 在28kDa处观察到重组GDH产物，这与我们基于该基因序列的预测一致。IPTG浓度和温度对GDH酶活性的影响，如图4所示在IPTG浓度为0.8 mmol / L和30oC时达到最佳活性，GDH酶活力为9.5 U /毫克。2.2、CR基因的筛选，克隆和表达以及诱导条件的优化为了获得能够将OPBE还原成（R）-HPBE并具有高产率和收率的新型还原酶，对不同来源的羰基还原酶进行克隆，并研究它们的酶活性（表3）。 来自枯草芽孢杆菌的IolS显示出最高的酶活性和对映选择性。 序列分析表明，iolS（933bp）编码310个氨基酸，IolS的计算分子量为36kDa。 IolS属于醛 - 酮还原酶（AKR）超家族。iolS的核苷酸序列已经被保藏在GenBank，保藏号为JQ782389。 图3显示大肠杆菌BL21（DE3）/ pET20b-iolS的无细胞提取物的SDS-PAGE。在约36kDa观察到表达的重组IolS产物，这与从基因序列预测一致。IPTG浓度和温度对IolS酶活性的影响如图5所示。在IPTG浓度为0.4 mmol / L和25oC时达到最佳活性，GDH酶活性为1.5 U /毫克。2.3、蛋白质纯化 用HisTrap-FF粗螯合亲和柱将N端His标记的重组酶IolS纯化至电泳均一性。 纯化的IolS的比活性为5.1U / mg，与粗提物相比纯度提高了3.4倍。 图6显示纯化后粗提物和目标级分的SDS-PAGE。2.4、羰基还原酶的酶活性表征羰基还原酶在30oC显示最大活性。 当温度升高时，活动迅速下降。 在高于40o的温度下酶是极其微弱的，如图7所示。还研究了pH对酶活性的影响。 结果显示在图8中。在pH 6.0（磷酸钠缓冲液）和 75的活性下观察到最大的酶活性在24小时后保持在pH 5.5和7.0之间。2.5、IolS和GDH的共表达含有不同质粒的大肠杆菌BL21（DE3）的IolS和GDH活性显示在表4中。含有pET-G-SD-I的大肠杆菌BL21（DE3）观察到最高的GDH活性，其中GDH活性为4.8 U / mg。 然而，观察到低得多的IolS活性（0.5U / mg）。 具有两个独立质粒（pET20b-iolS和pET24a-gdh）的大肠杆菌BL21（DE3）分别显示出0.9和3.4U / mg的IolS和GDH活性。在所使用的三种策略中，用携带pET-G-T7-I的大肠杆菌BL21（DE3）获得最高的IolS活性（1.5U / mg），其中GDH显示与IolS相当的活性（1.5U / mg）。 对大肠杆菌BL21（DE3）/ pET-G-T7-I的诱导条件进行了优化，结果表明IPTG浓度为0.8 mmol / L，诱导温度为25o GDH和IolS（数据未显示）。 因为IOLS是OPBE降低的关键酶，并且具有类似的GDH活性，所以选择大肠杆菌BL21（DE3）/ pET-G-T7-I作为后续实验的生物催化剂。 从转录和翻译的角度出发，利用独立的T7启动子和位于iolS上游的rbs序列，pET-G-T7-I能够有效地转录两个mRNA：其中一个包含GDH和IolS的编码信息，另一个包含IolS的编码信息。 因此，iolS可以被转录和翻译两次，导致增强的酶表达水平。 这也与我们的实验结果一致。GDH的表达IolS在图9中显示，表明IolS和GDH在携带pET-G-T7-I的重组大肠杆菌菌株中高度表达。2.6、OPBE生物还原成（R）-HPBE在大肠杆菌BL21（DE3）/ pET-G-T7-I催化的水性体系中OPBE向（R）-HPBE生物还原的生物还原时间过程如图10所示。反应13h后，超过99在10g / L的OPBE下，产率达到99.5ee。2.7、讨论在芽孢杆菌亚种中鉴定出羰基还原酶（IolS）R）-HPBE对映选择性（ 99.5）。将重组IolS纯化至均一并表征。 通过共表达iolS和gdh来解决氧化还原酶催化反应中的辅因子再生问题。 追求两种共表达方法：在一个表达质粒中串联表达gdh / cr，其中SD序列，T7启动子和其他特殊序列插入到两个基因之间17,18，第二种方法是将两个独立的重组体将质粒转化到大肠杆菌细胞中构建双质粒系统19,20。 结果表明T7启动子和rbs序列的插入有利于iolS的表达。 在含水系统中，大肠杆菌BL21（DE3）/ pET-G-T7-I催化的OPBE向（R）-HPBE的生物还原只需要0.05mmol / L的NADP+，这导致99的收率和10g / L OPBE时为99.5ee。 为了进一步提高反应效率和底物浓度，进行了包括底物补料，水/有机两相体系和pH调节在内的反应过程的优化研究。三、结论总之，克隆来自枯草芽孢杆菌的羰基还原酶基因（iolS）和葡萄糖脱氢酶（GDH）基因。 已经构建了能够高度立体选择性还原OPBE至（R）-HPBE的重组大肠杆菌，并进行了内部辅酶再生，为通过生物催化工业生产（R）-HPBE提供了可行的方法。四、参考文献1、Herold P，Indolese AF，Studer M，Jalett HP，Siegrist U，Blaser H U.Tetrahedron，2000,56：64972、Zhang XF，Zheng Y G. 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