H7亚型禽流感RT-PCR检测方法的建立、条件优化及应用

华南农业大学大学生科技创新活动项目H7亚型禽流感特异性RT-PCR检测方法的建立、条件优化及应用徐珊、张停婷、陈梓栋（华南农业大学兽医学院 广州 510640）指导教师: 辛朝安、任涛 职称 教授、副教授所在院部：兽医学院 专业年级：动物医学2002级华南农业大学大学生科技创新活动项目指导中心H7亚型禽流感特异性RT-PCR检测方法的建立、的条件优化及应用徐珊，张停婷，陈梓栋(华南农业大学兽医学院 ，广东 广州 510640)摘要：参照GenBank中已发表的H7亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因设计合成了一对的特异性强、敏感性高的引物 ，预计扩增片段的大小约为310 bp ，利用这对引物，通过对RT-PCR反应体系和反应条件的优化，建立了针对H7亚型高致病性禽流感的特异性RT-PCR检测方法。敏感性试验和特异性试验结果表明，该方法敏感性高，对H7亚型AIV尿囊液能检出的最低稀释度可达10-4 ，相当于0.8102.76EID50（半数感染量），且应用该引物对NDV（新城疫病毒）、IBV（传染性支气管炎病毒）及流感其他亚型（H1、H3、H5、H9）在相同反应条件下扩增没有出现假阳性反应。用所建立RT-PCR方法检测发病鸡组织病料及咽、肛拭子，检测结果与鸡胚病毒分离结果相比阳性符合率高达90.6。完成此RT-PCR反应程序只需3-4小时。结果表明，该方法具有快速、敏感、特异等优点，同时还具有较好的生物安全性。是AIV H7亚型鉴定和快速诊断的有效方法。关键词： H7亚型禽流感RT-PCR检测 Development and optimization of a specific RT-PCR method for detecting H7 subtype of avian influenza virusXu Shan，Zhang Tingting，Chen Zidong (Veterinary College of South China Agricultural University,GuangZhou Guangdong 510640 ） Abstract:A specific RT-PCR detection system was developed and optimized to detect the highly pathogenic AIV H7 subtype.A set of specific primers was designed for AIV H7 subtype in this experiment,which was predicted to amplify a product of 310bp in length.The sensitivity and the specificity assays indicated that allantoic fluid could be identified by this specific RT-PCR is 10-4 ,which is about 0.8102.76 of 50% egg infections dose and no false positive results were observed when allantoic fluid samples with NDV、IBV as well as other subtypes of AIV were assayed under the same reation condition .The coincidence of positive rate was up to 90.6% between the detection to tissues and swabs of nonimmune fowl by this RT-PCR ,and the viral isolation of embryos .The whole RT-PCR proceduce was completed in about 3-4h.The method therefore provide rapid,simple,safe,sensitive,subtype-specific dianosis of subtype H7 of avian influenza virus in clinical samples.KEY WORDS：H7 subtype of avian influenza、Specific RT-PCR、Detect禽流感（AI）,是由正黏病毒科流感病毒属的A型流感病毒（AIV）引起的禽类的一种从呼吸系统到严重的全身性败血症等多种症状的综合症。被国际兽疫局定为A类传染病，我国把高致病性禽流感列为一类传染病1、2。A型禽流感病毒基因组由8个基因片段组成即PA、PB1、PB2、NS、NP、M、HA、NA，共编码10种蛋白，在病毒的表面结构蛋白中，HA的变异幅度最大，也是诱导体液免疫的最主要保护性抗原。根据血凝素HA和神经氨酸酶NA的不同目前已发现AIV有15个H亚型。一般认为，同一亚型AIV之间有良好的交叉免疫保护作用。迄今为止，造成AI大爆发的AIV均为H5和H7亚型3、4、5。从1959年开始，H7亚型的禽流感相继在欧洲，大洋洲爆发。进入本世纪，AIVH7疫情也不断有报道。虽然我国暂无AIVH7的爆发。但建立起敏感、特异、快速的AIVH7诊断预防措施是非常必要的。鉴于目前检测AIV常用的鸡胚病毒分离法耗费的时间长（一周左右），且存在散毒的危险，本文利用聚合酶链式反应（PCR）的敏感、特异、快速的优点6，针对AIVH7的HA基因设计合成特异性高的引物建立H7的RT-PCR诊断方法，并进行条件优化，提高诊断的敏感性和特异性，为AIVH7亚型RT-PCR快速诊断试剂盒的研制打下坚实基础，对我国AIVH7的诊断和预防控制具有十分重要的意义。1材料和方法1.1材料1.1.1病毒AIV H7 亚型毒株A/Duck/Guangdong/01/2003（H7N3）及其他亚型（H1、H3、H5、H9）的毒株、NDV LaSota株、IBV IBV-SC-93、ILTV毒株，IBDV毒株，均由华南农业大学兽医学院禽病实验室保存。1.1.2非免疫鸡和鸡胚1天龄非免疫鸡：购自广东省农科院畜牧研究所，在本研究室动物舍养至21天龄。911日龄非免疫鸡胚:均购自佛山墟岗黄种鸡场1.1.3主要试剂Trizol为GIBCO公司产品，dNTPs(each 2.5mmol)、10Ex Taq DNA polymerase Buffer 、Reverse Transcriptase XL（AMV）、核糖核酸酶抑制剂（PRI）、反转录引物、Ex-TaqTM DNA聚合酶、DNA Marker DL2000均为宝生物工程（大连）有限公司产品，其余试剂均为分析纯。1.2方法1.2.1引物设计与合成根据GenBank中注册的AIV HA基因序列，借助DNASTAR软件，设计合成了一对针对AIVH7的引物 SN1和SN2 预计扩增片段大小约为310bp。引物序列如下：SN1：5TCTTCDTTCTATGCRGAGATGAA TRAARGTVACYGTGTCATTRG 3（D=A/G/T,R=A/G,V=A/G/C,Y=C/T）1.2.2 病毒的复壮将A/Duck/Guangdong/01/2003（H7N3）作10倍连续稀释至10-3，接种5枚鸡胚，0.2ml/枚，37培养。弃24h内的死胚。之后每隔12h照胚一次，将死亡鸡胚4冻存，96h后将所有鸡胚4冻存。4冻存过夜后收获尿囊液，测HA滴度为1：256，测HI为AIV H7阳性，-200C保存备用。1.2.3 病毒半数感染量的测定将复壮的A/Duck/Guangdong/01/2003（H7N3）毒株尿囊液作10倍连续稀释从10-1至10-10，并设一不作稀释的尿囊液用于阳性对照，每个稀释度各接种8枚10日龄的非免疫鸡胚，每枚接种0.2ml，全部鸡胚于37培养，弃去24h内的死胚，之后每隔12h照胚一次，将死亡鸡胚4冻存，96h后收获尿囊液，测定尿囊液的HA滴度，若HA滴度1：20即判定为阳性，HA滴度1：40则判定为阴性。计算公式为：（高于50%的%50%）/（高于50%的%低于50%的%）校正，校正后可以得到精确到两位小数的病毒半数感染量5。1.2.4总RNA的抽提按Trizol Reagent抽提使用说明书进行：在250L鸡胚尿囊液中加入750 L 冰冷的Trizol Reagent，剧烈振荡大约20-30s后在室温放置5min。加入200ul氯仿后再次剧烈振荡15s。而后12,000rpm 0C离心15min。小心移取上层水相到一个新的离心管中，向取出的上清液加入等量的异丙醇，轻轻地上下颠倒3次后-200C静置10min，然后12,000rpm 40C离心15min后弃上清，再加入1mL 冰冷的75乙醇，轻轻旋转离心管充分洗除管壁及管底的异丙醇，而后-200C静置3-5min后12，000rpm 40C离心7min,倾倒出乙醇后风干（RNA不能过于干燥，否则难溶于水）。加入1 0L DEPC 水溶解RNA，直接进行反转录或-200C保存备用。1.2.5RT-PCR条件的建立和优化通过调整反转录条件、PCR的退火温度、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物用量及循环参数，对反应条件进行优化，确定最佳的RT-PCR反应体系，以提高其检测敏感性和特异性。1.2.6RT-PCR的特异性试验将从AIV-H7、NDV、IBV、流感的其他亚型病毒尿囊液及阴性尿囊液提取的RNA分别加入到该RT-PCR反应体系中，在相同的条件下进行扩增，并用1的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。1.2.7RT-PCR的敏感性试验将AIVH7的感染性尿囊液作10倍连续稀释从10-1至10-6，抽取RNA，在该RT-PCR反应体系中进行扩增，用1的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，分析其敏感性。1.2.8 DNA序列分析将特异性试验RT-PCR产物电泳后切下含目的片段的凝胶，回收纯化、克隆、测序，登陆NCBI网站，进行Blast，比较同源性。1.2.9临床样品检测（1）非免疫鸡组织脏器、咽和肛拭子的RT-PCR与鸡胚病毒分离检测方法的比较：对21天龄的非免疫鸡，以静脉注射和肌肉注射两种途径接种滴度为1：256的AIVH7尿囊液，同时设立NDV、IBV等对照组。攻毒后第三天起分别采集咽拭子、肛拭子及组织病料。将棉拭子放入灭菌的DMEM培养基中，处理后3000rpm离心5min，取上清；组织病料经研磨后，反复冻溶两次后3000rpm离心5min，取上清。采集的样品同时分别进行RT-PCR检测及鸡胚病毒分离培养，计算两种方法的阳性符合率。（2）模拟临床大量样品的检测：对实验室保存的NDV、IBV、ILTV、IBDV等，以及多个亚型禽流感病毒生物学特性研究和疫苗研究时所采集的样品，进行AIV H7亚型RT-PCR模拟临床检验，分析结果并比较与鸡胚病毒分离法的符合率。2结果2.1 病毒半数感染量测定结果 表1半数感染量测定结果（EID50）病毒液的稀释度干扰凝血观察结果累计干扰凝血结果阳性总胚数阳性胚数所占总数的%阳性胚数阴性胚数阳性胚数阴性胚数1018050050100%1028042042100%1038034034100%1047126127 96.2%105621932286.3%106531361968.4%10-7448101844.4%10-8254151921.1%10-917222248.3%10-1017129303.3%阳性对照80-*被检病毒是A/Duck/Guangdong/01/2003（H7N3）株，其中HA滴度1：20为阳性，HA滴度1：40为阴性；累计胚数分别按箭头方向累加。由表1第七列数据可知病毒半数感染量在106和107之间，结果校正：（68.4%50%）/(68.4%44.4%)0.76，所以该复壮后的A/Duck/Guangdong/01/2003（H7N3）毒株尿囊液的病毒半数感染量=106.76/0.2ml。2.2RT-PCR反应体系的建立 （1）反转录优化结果如下：20L反应体系：5AMV Buffer 4L，2.5mmol each dNTPs 4L,Reverse Transcriptase XL(AMV)（20U） 1L, Rnasin 1L(20U),反转录引物1L(30pmol/ul)，用DEPC处理过的 ddH20补足体积至20L,瞬时离心混匀。反应程序： 420C水浴1h，冰浴2min，直接用于PCR扩增或于-200C保存备用 。 （2）RT-PCR反应体系优化结果如下： 25L反应体系： ddH2O 16.7L；10Ex Taq Buffer 2.5L；2.5mmol each dNTPs 2.5L；上、下游引物(20pmol/ul)各0.5L；Ex Taq DNA聚合酶 0.3L(2.5U)；反转录产物 2L。反应程序：950C 3min；950C 45s；52.20C 45s；720C 45s；30个循环；720C 8min。2.3特异性试验结果该RT-PCR方法对AIVH7 RNA扩增单一的核酸带，经与DNA分子量标准比较，证实其大小约为310bp，与预计值相符。而对NDV、IBV、流感其他亚型和阴性尿囊液抽取的RNA进行RT-PCR扩增，均未见特异性扩增带。见图1 图1 AIV H7亚型RT-PCR特异性试验结果 M：DL2000 DNA Marker；1：阴性尿囊液；2：AIV H1尿囊液；3：AIV H3尿囊液；4：AIV H5 尿囊液；5：AIV H7尿囊液；6：AIV H9尿囊液；7：IBV尿囊液8：NDV尿囊液2.4敏感性试验结果将AIVH7的感染性尿囊液作10倍系列稀释，抽取RNA，在该RT-PCR反应体系中进行扩增，用1的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果显示，该RT-PCR的灵敏度可达10-4相当于0.8102.76EID50，结果见图2。图2 AIV H7亚型RT-PCR敏感性性试验结果 M：DL2000 DNA Marker；+：AIV H7阳性尿囊液；1-6：10-1-10-6 10倍梯度稀释AIV H7尿囊液2.5 DNA测序结果与分析将特异性试验RT-PCR产物电泳后切下含目的片段的凝胶，回收纯化、克隆、测序，测序结果提交NCBI，进行BLAST分析。BLAST结果均为AIV H7。应用DNASTART软件，将目的片段序列与已经在Genbank中注册的部分AIV H7亚型流感病毒代表毒株进行比较，结果发现同源性在92.6%-97.1%之间，表明利用所设计的引物扩增出来的目的片段序列与Genbank上参考序列的基因亲缘性非常近，验证了目的条带确实是AIV H7亚型的特异性核酸片段，说明本试验所建立的RT-PCR方法具有较高的特异性，见图3、图5 图3：AIV H7发育进化树A7为本试验设计的引物所扩增出来的目的片段序列；其余为Genbank上注册的部分AIV H7亚型流感病毒代表毒株。2.6临床样品检测结果（1）对采集的咽拭子、肛拭子及组织病料的RT-PCR检测和鸡胚病毒分离结果比较阳性符合率高达90.6，见图4、表2、表3。（2）对实验室AIV多个亚型及NDV、IBV、ILTV生物学特性研究、疫苗研究等采集的样品进行AIV H7亚型特异性RT-PCR模拟临床检验，结果表明该RT-PCR检测方法的特异性为100，与鸡胚病毒分离法的符合率高达90.5，见表4。图4 临床样品检测结果 M： DL2000 DNA Marker；+：阳性（310bp）；-：阴性；1-4：AIV H7咽拭子；5-8：AIV H7肛拭子；9-15：AIV H7组织病料表2 拭子样品的检测攻毒后天龄（d） RT-PCR(+) 鸡胚病毒分离（+）3 2/6a 3/6b4 2/6 2/65 4/6 5/66 4/6 4/67 3/6 3/68 4/6 4/69 3/6 3/610 2/6 2/611 2/6 2/612 1/6 1/613 2/6 2/614 0/6 1/615 0/6 0/6a:分母表示采集拭子样品数，分子表示RT-PCR阳性数；+：阳性 表3 泄殖腔拭子样品的检测攻毒后天龄（d） RT-PCR(+) 鸡胚病毒分离（+）3 1/6b 2/6b4 2/6 2/65 4/6 4/66 4/6 4/67 3/6 3/68 4/6 5/69 3/6 4/610 2/6 2/611 1/6 2/612 2/6 2/613 1/6 1/614 0/6 0/615 0/6 0/6b:分母表示采集拭子的样品数，分子表示病毒分离阳性数；+：阳性表4 模拟临床试验H7亚型RT-PCR检测毒株 咽拭子 肛拭子 组织病料鸡胚病毒分离AIVH1 0/20c 0/20 0/20 AIVH3 0/20 0/20 0/20AIVH5 0/18 0/18 0/18AIVH7 27/100 23/100 38/100AIVH9 0/25 0/25 0/25NDV 0/32 0/32 0/32IBV 0/40 0/40 0/40ILTV 0/35 0/35 0/355/20c 7/205/1842/1004/258/3216/4011/35 c:分母表示所采集样品数，分子表示检测样品的阳性数；+：阳性 3讨论 禽流感（AI），是一种世界范围内的禽类疫病，在有记载的禽病史上，每一次严重的暴发和流行都给养禽业带来巨大的经济损失和公共卫生威胁，因此该病具有重要的公共卫生意义。 AIV RNA是由8个基因片段组成，在复制过程中很容易发生基因的重排，决定了AIV的血清亚型众多、变异频繁的特点。目前，传统的AIV检测方法主要有病毒分离和血清学诊断，但其不足之处在于操作繁琐、诊断时间长，结果重复性不好等。近来研究发现，用鸡胚分离培养的流感病毒常出现宿主介导的变异，使诊断的特异性普遍不高。而PCR技术具有其特异性强、灵敏度高、快速简便及重复性好的优点。本文是根据GenBank中注册的AIV HA基因序列，设计合成一对针对AIV-H7亚型的特异性引物，并优化RT-PCR的反应条件和反应程序，建立敏感、特异、快速的AIV-H7亚型 RT-PCR检测方法。该RT-PCR的特异性试验结果显示：AIV-H7亚型在310bp的位置上出现的特异的扩增带，而NDV、IBV、流感其他亚型和阴性尿囊液则无扩增带出现。回收纯化、克隆PCR扩增的310bp目的片段，并测序，测序结果提交NCBI，进行BLAST分析。BLAST结果均为AIV H7。应用DNASTART软件，对目的片段序列与已经在Genbank中注册的部分AIV H7亚型流感病毒代表毒株进行比较，结果发现同源性在92.6