SAD和FAD家族基因调控山核桃不饱和脂肪酸组分配比

园艺学报 2018 45 2 250 260 Acta Horticulturae Sinica 250 doi 10 16420 j issn 0513 353x 2017 0378 http www ahs ac cn 收稿日期 收稿日期 2017 08 11 修回日期 修回日期 2018 02 02 基金项目 基金项目 国家高科技研究发展计划项目 2013AA102605 国家自然科学基金项目 31470682 31670682 浙江省自然科学基金项 目 LY18C150002 通信作者 Author for correspondence E mail huangjq TelSAD和FAD家族基因调控山核桃不饱和脂肪酸 组分配比 黄春颖 黄有军 吴建峰 黄 仁 栾雨濛 张深梅 王正加 张启香 黄坚钦 浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室 浙江临安 311300 摘 要 摘 要 以山核桃胚为试材 测定 5 个山核桃油脂合成积累关键时期 授粉后 75 85 100 109 和 127 d 的油脂组分和油含量 并利用实时荧光定量 PCR 检测山核桃 9 硬脂酰 ACP 脱氢酶 SAD 基因 CcSAD 1 CcSAD 2 CcSAD 3 和山核桃脂肪酸去饱和酶 FAD 基因 CcFAD2 CcFAD3 1 CcFAD3 2 CcFAD3 3 CcFAD6 CcFAD7 CcFAD8 1 CcFAD8 2 CcFAD8 3 的表达模式 结果表明 成熟的山核桃种仁含油率超过种仁干质量的 70 同时不饱和脂肪酸比例达到 90 以上 山核桃 5 个时 期的脂肪酸组分 主要由棕榈酸 C16 0 硬脂酸 C18 0 油酸 C18 1 亚油酸 C18 2 以及亚麻酸 C18 3 组成 随着山核桃 SAD 家族基因表达上升 山核桃油中的油酸含量上升并维持一定水平 其 中 CcSAD 3 可能是影响油酸含量的主效基因 同时随着山核桃油酸含量上升 CcFADs 基因表达上升 山 核桃不饱和脂肪酸比例增加 关键词 关键词 山核桃 SAD FAD 油脂合成 中图分类号 中图分类号 S 664 文献标志码 文献标志码 A 文章编号 文章编号 0513 353X 2018 02 0250 11 SAD and FAD Genes Regulate the Ratio of Unsaturated Fatty Acid Components in Carya cathayensis HUANG Chunying HUANG Youjun WU Jianfeng HUANG Ren LUAN Yumeng ZHANG Shenmei WANG Zhengjia ZHANG Qixiang and HUANG Jianqin State Key Laboratory of Subtropical Silviculture Zhejiang A F University Lin an Zhejiang 311300 China Abstract Taking the hickory Carya cathayensis Sarg embryo as the test material five periods 75 85 100 109 and 127 days after pollination of hickory embryo which are critical for the oil synthesis and integration are measured by gas chromatography to study the law of hickory oil Additionally Stearoyl ACP desaturase genes CcSAD 1 CcSAD 2 CcSAD 3 and fatty acid desaturase genes CcFAD2 CcFAD3 1 CcFAD3 2 CcFAD3 3 CcFAD6 CcFAD7 CcFAD8 1 CcFAD8 2 CcFAD8 3 were studied by quantitative real time PCR The results revealed that hickory oil mainly composed of palmitic acid C16 0 stearic acid C18 0 oleic acid C18 1 linoleic acid C18 2 and linolenic acid C18 3 黄春颖 黄有军 吴建峰 黄 仁 栾雨濛 张深梅 王正加 张启香 黄坚钦 SAD 和 FAD 家族基因调控山核桃不饱和脂肪酸组分配比 园艺学报 2018 45 2 250 260 251 hickory is a high oleic species In addition quantitative results showed that with the increase of Stearoyl ACP desaturase genes expression the oleic acid content in hickory oil increased and reached dynamic balance Gene expression profiling and lipid analysis in hickory fruit during development identify CcSAD 3 as the main gene responsible for the oleic acid content in hickory oil Meanwhile with the increase of oleic acid content in the hickory oil the expression of CcFADs increased and the proportion of unsaturated fatty acids in hickory oil increased Keywords Carya cathayensis SAD FAD synthesis of lipids 山核桃 Carya cathayensis Sarg 是中国特有的干果和油料树种 Mexal et al 2003 成熟山 核桃种仁含油率为 69 8 74 01 是木本油料中最高的一种 其中不饱和脂肪酸含量为 88 38 95 78 比被称为 液体黄金 的油橄榄油含量高 章亭洲 2006 美国心脏学会 American Heart Association AHA 认为不饱和脂肪酸组成比例在维持人体生理平衡和生长方面具有重要作用 最 佳的 6 3 值为 1 4 1 花生油 芝麻油 玉米油和葵花籽油中的 6 3 比值分别为 411 1 95 1 95 1 和 5 481 1 Yang et al 2013 而山核桃油中 6 3 比值为 1 69 1 符合人体所需 的最佳比值 植物油为人类提供所需的多种脂肪酸 它主要以三酰甘油 Triacylglycerols TAGs 的形式贮 存在种子或果实中 叶片和其他营养组织中有少量存在 Slocombe et al 2009 植物脂类代谢途 径相当复杂 在种子发育过程中 油脂的合成大致可以分为 3 个阶段 1 在质体中将乙酰 CoA Acetyl CoA 作为最初底物合成 16C 18C 的脂肪酸 2 脂肪酸被运输至内质网后 碳链延长 和脱饱和形成各种脂肪酸 3 脂肪酸与甘油进一步被加工成三酰甘油 以油体的形式储存起来 周 丹 等 2012 在植物质体中 9 硬脂酰 ACP 脱氢酶 Stearoyl ACP desaturase SAD 以硬脂酰 ACP C18 0 ACP 为底物 催化生成油酰基 ACP C18 1 ACP 油酰基 ACP 在硫酯酶的作用下解 离 转运至内质网进行三酰甘油的组装或再延长去饱和等过程 生成多不饱和脂肪酸 Yukawa et al 1996 SAD 是植物脂肪酸合成通路中一个重要的分支点 是不饱和脂肪酸合成过程中不可缺少的 关键酶 SAD 直接决定了植物油脂中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例 Mckeon Stumpf 1982 对调节油料作物种子中脂肪酸组成比例具有重要作用 脂肪酸去饱和酶 Fatty acid desaturase FAD 可以催化脂肪酸链的特定位置形成双键并产生不 饱和脂肪酸 主要包括 7 种 即 FAD2 Okuley et al 1994 FAD3 Arondel et al 1992 FAD4 Ohlrogge Browse 1995 FAD5 Ohlrogge Browse 1995 FAD6 Zhang et al 2009 FAD7 Iba et al 1993 和 FAD8 Los Murata 1998 在动物研究中还发现了 FAD9 Man et al 2006 FAD4 和 FAD5 以 16 碳原子的脂肪酸为底物 催化 16 1 的脂肪酸生成 16 2 脂肪酸 FAD2 FAD3 FAD6 和 FAD7 以 18 碳原子的脂肪酸为底物 其中 6 型去饱和酶 FAD2 和 FAD6 在 6 12 位置 引入双键 将油酸 18 1 催化生成亚油酸 18 2 3 型去饱和酶 FAD3 FAD7 和 FAD8 在 3 15 位置引入双键 将亚油酸催化生成亚麻酸 18 3 Somerville Browse 1996 在植物油脂合成 途径中 脂肪酸去饱和酶的含量和活性决定着油脂中不饱和脂肪酸的成分和比例 林萍 等 2016 本研究中通过测定各时期山核桃果实中的油脂组分 了解其生长发育过程中脂肪酸组分变化 分析影响山核桃油脂组分的 SAD 和 FAD 家族基因的序列特征和基因表达 以期探究 SAD 和 FAD 在山核桃油脂合成过程中的功能 为解释山核桃高油机制和山核桃育种工作奠定基础 Huang Chunying Huang Youjun Wu Jianfeng Huang Ren Luan Yumeng Zhang Shenmei Wang Zhengjia Zhang Qixiang Huang Jianqin SAD and FAD genes regulate the ratio of unsaturated fatty acid components in Carya cathayensis 252 Acta Horticulturae Sinica 2018 45 2 250 260 1 材料与方法 1 1 材料与采样 山核桃样品于 2015 年 7 月 20 日至 9 月 6 日采集于浙江省杭州市临安太湖源指南山村 119 577 981 E 30 361 774 N 选取 30 年龄以上盛果期山核桃树 采集授粉后 79 d 油脂积累初期 85 d 油脂积累增速启动期 100 d 油脂积累快速增长期 109 d 油脂积累平缓期 和 127 d 油脂 积累平衡期 的果实 迅速保存在液氮中带回实验室 80 保存 用于油脂组分测定和相关基因 的表达分析 1 2 生理指标与基因扩增和定量表达分析 粗脂肪测定参照 GB T 14772 2008 粗脂肪测定方法 脂肪酸组分测定参照 GB T 17376 2008 酯交换测定方法 根据山核桃基因组 山核桃基因组信息未释放 注释信息检索得到 3 个 SAD 家族成员 分别是 CcSAD 1 CcSAD 2 和 CcSAD 3 都含有典型的 Ferritin like superfamily 功能结构域 同样方法 检 索得到 9 个 FAD 家族成员 分别是 CcFAD2 CcFAD3 1 CcFAD3 2 CcFAD3 3 CcFAD6 CcFAD7 CcFAD8 1 CcFAD8 2 和 CcFAD8 3 都含有典型的 Membrance FADS like super family 功能结构域 不同发育时期的山核桃胚 授粉后 79 127 d 总 RNA 的提取采用 CTAB 法 试剂盒法 用 CTAB 法得到粗提物 然后再用试剂盒 TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 精提 RNA cDNA 合成采用 PrimeScriptTM RT reagent Kit Perfect Real Time 根据检索得到的基因 CDS 序列 用 Primer Premier 5 软件设计扩增引物 表 1 由生工生物工程 上海 股份有限公司合成 参照 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 使用说明扩增目的片段 扩增产物用快速琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 生工 回收 并连接到 PMD18 T Vector TaKaRa 公司 转化 Escherichia coli DH5 感受态细胞 TaKaRa 公司 挑选阳性克隆 经菌液 PCR 检测后送生工生物工程 上海 股份有限公司进行基因测序 根据检索得到的基因 CDS 序列以及定量 PCR 对引物的要求 产物长度控制在 200 bp 以内 退火温 度在 58 65 利用 Primer Premier 5 软件 在家族基因非同源区设计定量引物对 并通过 PCR 验证不会产生非特异性扩增 表 1 qRT PCR 使用 SYBR Premix Ex TaqTM TliRNaseH Plus Kit 并在 CFX96TM Real time System 实时荧光定量 PCR 仪上运行 Bio RAD C1000 Touch Thermal Cycler 条件为 95 预变性 30 s 95 5 s 60 30 s 40 个循环 以山核桃 Actin 作为内参 用 2 CT法计算目的基因的相对表达量 Livak Schmittgen 2001 设置 3 次重复 1 3 生物信息学分析及数据分析制图 使用在线数据库 http www ncbi nlm nih gov Structure cdd wrpsb cgi 分析相应功能结构域 使用在线软件 Gene Structure Display Server http 用Mega7 0比对基因编码氨基酸序列 默认参数 Bootstrap replications为1 000构建邻接树 Neighbor joining NJ 使用在线分析工具 MEME http meme suite org tools meme 预测编码蛋白保守结 构域 使用在线分析工具 Clustal Omega http www ebi ac uk Tools msa clustalo 比对 FAD 家族 基因编码氨基酸序列 比对结果用在线工具 BoxShade http www ch embnet org software BOX form html 显示 采用 SPSS18 0 及 GraphPad Prism 5 软件对试验数据进行处理和制图 差异显著性分析 采用 LSD 和 Duncan s 法 黄春颖 黄有军 吴建峰 黄 仁 栾雨濛 张深梅 王正加 张启香 黄坚钦 SAD 和 FAD 家族基因调控山核桃不饱和脂肪酸组分配比 园艺学报 2018 45 2 250 260 253 表表 1 引物序列引物序列 Table 1 Sequence of primers 用途 Application 基因名称 Gene name 前引物序列 5 3 Forward primer 后引物序列 5 3 Reverse primer 基因克隆 CcSAD 1 ATGGCTCTCAAACTCTGTTTTT TTAGAGCTTCACATTTCTATCAAAA Gene cloning CcSAD 2 ATGGCTCTCAAACTCGGTATT TTAGAGCTTCACTTCTCTATCAAAA CcSAD 3 ATGCTTAATACCCTGGATGGAG CTAGCAAGTAGCAACAGGAGGA CcFAD2 ATGGGTGCCGGTGGC TCACAGCTTGTTGTTGTACCAG CcFAD6 ATGGGTGCCGGTGGTC CTACAGCTTATTGGCGTACCA CcFAD3 1 ATGGGAACTTTGGATATATCG TCATCCATGAGTGTTGACAGC CcFAD3 2 ATGGAGGCCGAGAAGAAGT TCATCCATGAGTGTTAAGAGCC CcFAD3 3 ATGGCAGAGTCGAAGAGGTAC TCATCCGTGAGTGTTGACAG CcFAD7 ATGGAGAAAGAAGGAGAGAATG TCAGATAGCCTTGCTCTTCAAA CcFAD8 1 ATGGAGGGAGGAGGAGGC TCAGTTAGACTTGTACCTAGAAGAT CcFAD8 2 ATGGCGAGCTGGGTCTTA TCACTTAGATGATGAGCCACTAAG CcFAD8 3 ATGGCGAGTTGGGTCATAA TCATTTTGATGCCTCGGG 表达分析 CcFAD2 TTACTGGGAGTTGGGGGAGC ATGGGTGCCGGTGGCCGAATGTTAG Expression CcFAD6 TCGCTTCAGCCTGTCGGATT ATGGGTGCCGGTGGTCGAATGGCAG analysis CcFAD3 1 GGTGCTCAATCTGAAACTGC ATGGGAACTTTGGATATATCGTGCA CcFAD3 2 TTGAGGAGAGGAGCATCGCC ATGGAGGCCGAGAAGAAGTACATCA CcFAD3 3 TAAGCCAATCGGAAACATCG ATGGCAGAGTCGAAGAGGTACATTT CcFAD7 GAAATCATCGTCCTCGTGGC ATGGAGAAAGAAGGAGAGAATGCAA CcFAD8 1 GCGCACTTGGGTCGAAAGCA ATGGAGGGAGGAGGAGGCGGA CcFAD8 2 GCACGAGACGGGTCCAGTTC ATGGCGAGCTGGGTCTTATCAGAAT CcFAD8 3 GATGCGACCCTTAGTGGAGC ATGGCGAGTTGGGTCATAACAGAAT CcSAD 1 AATACCCTGGATGGAGTTCAAGATG TACTTGTTAAGAAGGTCACCATGCC CcSAD 2 TCTGTTTTTTCACTTCTCAACCTCC AGCTAAGGGTTGAGGCCATGAAGAA CcSAD 3 CCCATTCCATGTCGCCACAAAAGAT GGGTCTGGCAGAAAATCCTGTGGTT CcActin GCTGAACGGGAAATTGTC AGAGATGGCTGGAAGAGG 2 结果与分析 2 1 山核桃 SAD 基因的克隆与结构分析 克隆获得 3 个山核桃 SAD 家族基因 CcSAD 1 CcSAD 2 CcSAD 3 图 1 以 CcSAD 1F R 为引物进行 PCR 扩增 得到 1 191 bp 左右的片段 同理 CcSAD 2 扩增片段长度 1 191 bp CcSAD 3 扩增片段长度 564 bp 图图 1 SAD 家族基因克隆家族基因克隆 Fig 1 The amplification of the members of the SAD gene family Huang Chunying Huang Youjun Wu Jianfeng Huang Ren Luan Yumeng Zhang Shenmei Wang Zhengjia Zhang Qixiang Huang Jianqin SAD and FAD genes regulate the ratio of unsaturated fatty acid components in Carya cathayensis 254 Acta Horticulturae Sinica 2018 45 2 250 260 如图 2 所示 CcSAD 1 CcSAD 2 CcSAD 3 都含有 3 个外显子 2 个内含子 内含子序列较长 图图 2 SAD 家族基因结构家族基因结构 Fig 2 The gene structure of the members of the SAD gene family 图 3 表示的是 SAD 家族基因保守 motif 由此可见 SAD 家族基因保守性相当高 图图 3 SAD 家族基因功能结构域保守性分析家族基因功能结构域保守性分析 Fig 3 The conservative analysis of gene function domains of the SAD gene family 2 2 山核桃 FAD 基因的克隆与结构分析 克隆获得 9 个山核桃 FAD 家族成员 图 4 CcFAD2 CcFAD3 1 CcFAD3 2 CcFAD3 3 CcFAD6 CcFAD7 CcFAD8 1 CcFAD8 2 和 CcFAD8 3 以 CcFAD2F R 为引物进行 PCR 扩增 得到 1 152 bp 左右的片段 同理 CcFAD3 1 扩增片段长 度 294 bp CcFAD3 2 扩增片段长度 1 344 bp CcFAD3 3 扩增片段长度 1 344 bp CcFAD6 扩增片段长 度 1 161 bp CcFAD7 扩增片段长度 1 143 bp CcFAD8 1 扩增片段长度 1 146 bp CcFAD8 2 扩增片段 长度 1 368 bp CcFAD8 3 扩增片段长度 1 359 bp 黄春颖 黄有军 吴建峰 黄 仁 栾雨濛 张深梅 王正加 张启香 黄坚钦 SAD 和 FAD 家族基因调控山核桃不饱和脂肪酸组分配比 园艺学报 2018 45 2 250 260 255 图图 4 FAD 家族基因克隆家族基因克隆 Fig 4 The amplification of the members of the FAD gene family FAD 家族基因系统进化树和基因结构分析表明 山核桃 FAD 家族成员聚类成两支 一支由成员 CcFAD2 CcFAD3 1 CcFAD3 2 CcFAD3 3 和 CcFAD6 组成 红色分支 另一支由成员 CcFAD7 CcFAD8 1 CcFAD8 2 和 CcFAD8 3 组成 绿色分支 绿色分支 FAD 基因含有较多内含子 CcFAD7 CcFAD8 1 CcFAD8 2 和 CcFAD8 3 都含有 8 个外显子 7 个内含子 而红色分支基因无内含子 只有 1 个外显子 图 5 图图 5 FAD 家族基因结构家族基因结构 Fig 5 The gene structure of the members of the FAD gene family 通过对山核桃 FAD 基因家族编码氨基酸序列比较 图 6 发现 除了 CcFAD3 1 只含有 1 个保 守组氨酸基序 Hisbox 外 其他成员都含有 3 个保守的组氨酸基序 即组氨酸序列 HXXXH HXXHH 和 HXXHH 组氨酸保守基序被认为是所有脂肪酸去饱和酶的特征性区域 该部位形成催化部位的 二铁聚体 由此形成酶的催化中心 Shanklin Cahoon 1998 是目前已克隆脂肪酸去饱和酶中均 存在的保守结构域 Teixeira et al 2009 Huang Chunying Huang Youjun Wu Jianfeng Huang Ren Luan Yumeng Zhang Shenmei Wang Zhengjia Zhang Qixiang Huang Jianqin SAD and FAD genes regulate the ratio of unsaturated fatty acid components in Carya cathayensis 256 Acta Horticulturae Sinica 2018 45 2 250 260 图图 6 山核桃山核桃 FAD 家族基因编码氨基酸序列比较家族基因编码氨基酸序列比较 相同和相似的残基分别显示在黑色和灰色的背景上 8 个去饱和酶保守组氨酸组分用 表示 4 个疏水区域用方框表示 Fig 6 Comparison of the deduced amino acid sequences of fatty acid desaturase genes Identical and similar residues are shown on a background of black and gray respectively The eight invariant histidines grouped in three different boxes characteristic for desaturases are indicated by asterisks and the four hydrophobic regions are denoted by boxes 黄春颖 黄有军 吴建峰 黄 仁 栾雨濛 张深梅 王正加 张启香 黄坚钦 SAD 和 FAD 家族基因调控山核桃不饱和脂肪酸组分配比 园艺学报 2018 45 2 250 260 257 2 3 山核桃不饱和脂肪酸变化分析 山核桃油脂组分主要由 5 种脂肪酸 表 2 组成 饱和脂肪酸 棕榈酸 C16 0 和硬脂酸 C18 0 不饱和脂肪酸 油酸 C18 1 亚油酸 C18 2 和亚麻酸 C18 3 成熟的山核桃 种仁含油率超过种仁干质量的 70 同时不饱和脂肪酸比例达到 90 以上 在授粉后 79 d 以亚油酸 含量最高 占总脂肪的 48 43 油酸 亚麻酸含量次之且含量相近 授粉后 85 d 亚麻酸含量下降 油酸含量快速上升 从 16 43 增长至 33 96 授粉后 100 d 油酸出现大幅度上升 增至 74 21 亚油酸下降至 16 43 而亚麻酸下降至 2 23 授粉后 109 d 油脂合成平缓期 油脂合成速率下 降 脂肪酸组分变化不明显 授粉后 127 d 油酸作为成熟期的主要组分 从 79 11 下降至 63 65 而含量仅次于油酸的亚油酸回升至 23 43 亚麻酸含量为 4 37 表表 2 不同发育阶段的山核桃胚含油率和脂肪酸组分配比不同发育阶段的山核桃胚含油率和脂肪酸组分配比 Table 2 Total lipid content and composition of different lipid classes from hickory embryo at different stages of development 授粉后天数 Days after pollination 含油率 Total oil 饱和脂肪酸 Saturated fatty acids 不饱和脂肪酸 Unsaturated fatty acids 棕榈酸 Palmitic C16 0 硬脂酸 Stearic C18 0 油酸 Oleic C18 1 亚油酸 Linoleic C18 2 亚麻酸 Linolenic C18 3 79 1 48 13 04 0 61 2 61 0 40 16 43 2 97 48 43 1 81 18 08 2 56 85 6 74 10 98 0 16 1 95 0 09 33 96 0 10 44 00 1 59 7 82 1 56 100 58 30 5 38 0 50 1 22 0 34 74 22 4 14 16 43 3 15 2 23 0 41 109 61 78 5 28 0 20 1 29 0 48 79 11 1 58 12 14 0 77 1 20 0 19 127 72 15 6 59 1 11 1 28 0 42 63 65 3 79 23 43 1 69 4 37 1 39 2 4 山核桃 SAD 家族基因转录表达 从山核桃 SAD 基因表达趋势发现 图 7 在油脂合成过程中 表达量整体呈先上升后下降趋 势 在授粉后 109 d 最高 结合表 2 发现 随着 CcSADs 表达量的上升 山核桃油中的油酸含量呈 上升趋势并维持较高水平 为脂肪酸去饱和酶提供催化底物 图图 7 山核桃山核桃 SAD 家族基因的相对表达量家族基因的相对表达量 Fig 7 Relative expression of Carya cathayensis SAD family genes 2 5 山核桃 FAD 家族基因转录表达 根据山核桃 FAD 家族基因在山核桃油脂合成 5 个关键时期表达量的变化趋势 图 8 可以看 出不同基因在各时期的变化量不同 CcFAD2 表达整体呈下降趋势 在授粉后 79 d 表达量最高 油 脂积累平衡期 授粉后 127 d 表达量最低 CcFAD6 表达呈先上升后下降趋势 在授粉后 109 d 表 Huang Chunying Huang Youjun Wu Jianfeng Huang Ren Luan Yumeng Zhang Shenmei Wang Zhengjia Zhang Qixiang Huang Jianqin SAD and FAD genes regulate the ratio of unsaturated fatty acid components in Carya cathayensis 258 Acta Horticulturae Sinica 2018 45 2 250 260 达量最高 CcFAD3 1 CcFAD3 2 和 CcFAD3 3 总体表达趋势相近 且各时期表达差异并不明显 CcFAD7 在授粉后 85 d 和 109 d 都有高表达 在油脂积累平衡期表达量最低 CcFAD8 1 CcFAD8 2 和 CcFAD8 3 表达趋势相近 整体表达先上升后下降 CcFAD8 1 在授粉后 127 d 表达量最高 CcFAD8 2 和 CcFAD8 3 在授粉后 109 d 表达量最高 图图 8 山核桃山核桃 FAD 家族基因的相对表达量家族基因的相对表达量 Fig 8 Relative expression of Carya cathayensis FAD family genes 3 讨论 SAD 是不饱和脂肪酸合成代谢的关键酶 直接决定了植物油脂中的不饱和脂肪酸的总量以及饱 和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例 Kachroo et al 2007 目前已从多种植物中分离获得 SAD 基因 的 cDNA 其中亚麻 Linum usitatissimum L Nd et al 2013 油茶 Camellia oleifera Abel 张 党权 等 2008 麻疯树 Jatropha curcas L Luo et al 2006 等大多数油料作物 SAD 基因的 ORF 长为 1 173 1 197 bp 编码 390 398 个氨基酸 本研究中获得的山核桃 SAD 基因 ORF 长为 564 1 191 bp 编码 187 396 个氨基酸 家族成员高度保守 SAD 家族基因在山核桃油脂合成过 程中的转录表达分析发现 随着 SAD 基因差异表达 山核桃油脂组分发生变化 随着 CcSADs 基因 表达上升 山核桃油中的油酸含量逐渐上升并保持较高水平 家族成员间表达有差异 且高表达的 CcSAD 3 可能是影响油酸含量的主效基因 FAD 基因被认为是控制高油酸特性的候选基因 Jung et al 2000a Schwartzbeck 等 2001 采用转基因技术抑制 FAD2 酶活性使玉米油的油酸含量从 25 上升到 64 Jung 等 2000b 通过 黄春颖 黄有军 吴建峰 黄 仁 栾雨濛 张深梅 王正加 张启香 黄坚钦 SAD 和 FAD 家族基因调控山核桃不饱和脂肪酸组分配比 园艺学报 2018 45 2 250 260 259 抑制 FAD2 酶活性提升了花生中油酸和亚油酸的比值 宋淑香等 2016 通过克隆和定量表达分析 凤丹 PoFAD2 在种子发育过程中的情况 认为通过对 PoFAD2 基因的正义表达或反义抑制有望培育 出多不饱和脂肪酸含量更高或偏低的转基因牡丹新品系 在山核桃油脂合成过程中 随着 SAD 基因表达上升 SAD 酶含量增加 油酸含量上升 随着 催化底物浓度增加 6 型去饱和酶基因 CcFAD6 表达也上升 然而油脂组分中亚油酸含量并未 上调 猜测原因一方面油酸在合成和转化的过程中 合成的量大于转化的量 所以山核桃油脂积累 后期仍以油酸含量为主 另一方面 前期课题组研究发现 在山核桃油脂积累过程中 脂肪酸氧合 酶 LOX 基因表达呈上升趋势 Huang et al 2016 氧化亚油酸和亚麻酸生成氧氢基脂肪酸 故油 脂积累后期山核桃油中亚油酸和亚麻酸含量并未因 FAD 家族基因的表达上升而上升 此外 在山核 桃中尽管 3 型去饱和酶基因有较多拷贝 但是由于其转录表达水平并不高 使得山核桃油中亚麻 酸含量相较于油酸和亚油酸含量而言较低 总而言之 随着 SAD 酶 FAD 酶的合成 山核桃油组 分在此消彼长的组分转换间 油酸含量逐渐上升 不饱和脂肪酸比例增加 最终达到动态平衡 综上 山核桃 SAD 和 FAD 家族基因在整个山核桃油脂合成过程中的差异表达 影响山核桃油 脂组分 研究发现在山核桃油脂积累后期 尽管 6 型去饱和酶基因高表达 但是亚油酸含量不升 反降 表明种子中亚油酸含量不仅仅是转录水平上的控制 酶的活性和蛋白质的流通量也可能是影 响亚油酸组成的关键因素 因此油脂组分间如何转换 脂肪酸去饱和酶之间如何互作仍需深入研究 当然 本研究中仅用 qRT PCR 检测来推断脂肪酸组分含量变化与基因表达之间的关系 尚缺乏 更为直接的证据 后期可通过转基因实验做进一步验证 李永华等 2015 认为菊花脂肪酸脱饱和 酶基因 CmFAD7 表达与菊花抗低温胁迫有一定关系 山核桃中的 SAD 和 FAD 家族基因功能有待发 掘 以期为良种选育提供新思路 References Arondel V Lemieux B Hwang I Gibson S Goodman H M Somerville C R 1992 Map based cloning of a gene controlling omega 3 fatty acid desaturation in Arabidopsis Science 258 5086 1353 Huang J Q Zhang T Zhang Q X Chen M Wang Z J Zheng B S Xia G H Yang X Y Huang C Y Huang Y J 2016 The mechanism of high contents of oil and oleic acid revealed by transcriptomic and lipidomic analysis during embryogenesis in Carya cathayensis Sarg Bmc Genomics 17 1 113 Iba K Gibson S Nishiuchi T Fuse T Nishimura M Arondel V Hugly S Somerville C 1993 A gene encoding a chloroplast omega 3 fatty acid desaturase complements alterations in fatty acid desaturation 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