细胞周期调控课件

细胞周期调控cellcycleregulation 细胞增殖周期 简称细胞周期 cellcycle 是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束开始到下一次有丝分裂结束为止所经历的整个序列过程 这个过程所需要的时间称为细胞周期时间 细胞周期 细胞周期周而复始地进行着 这种周期性的重复过程受到严格地控制 使得不同的细胞周期事件在空间和时间上相互协调 研究背景细胞周期的检验点细胞周期蛋白CDK及其调控生长因子 癌基因和抑癌基因细胞周期与肿瘤 内容提要 一 研究背景1 MPF的发现及其作用1960年 Masui和Markert研究爪蟾卵母细胞 提出了成熟卵母细胞中存在一种促成熟因子 maturationpromotingfactor MPF Rao和Johnson 1970 1972 1974 以Hela细胞为材料 发现M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子 即促细胞分裂因子 mitosis promotingfactor MPF 2 cdc基因LelandHartwell PaulNurse分别以不同的酵母为实验材料 发现了许多与细胞分裂有关的基因 celldivisioncyclegene CDC 如芽殖酵母的cdc28 裂殖酵母cdc2基因 进一步研究发现 P34cdc2与P34cdc28是同源物 二者本身并不具有激酶活性 只有当其与有关蛋白结合后 其激酶活性才能够表现出来 例如 P34cdc2必须与另一种蛋白P56cdc13结合后才具有激酶活性 3 cyclin1983年TimothyHunt首次发现海胆卵受精后 在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡 在每一轮间期开始合成 G2 M时达到高峰 M结束后突然消失 在下一个周期中又重复这一消长现象 故命名为周期素或周期蛋白 cyclin 随后cyclin很快被分离和克隆出来 证明其广泛存在于从酵母到人类等各种真核生物中 而且在功能上存在互补性 4 MPF P34cdc2 Cyclin 1988年M J Lohka纯化了爪蟾的MPF 经鉴定由34KD和45KD两种蛋白组成 二者结合可使多种蛋白质磷酸化 1990PaulNurse进一步的实验证明P34实际上是P34cdc2的同源物 P45是cyclinB的同源物 而且 对于P34cdc2的活性而言 cyclin是必需的 从而将细胞周期三个领域的研究联系在一起 fortheirdiscoveriesofkeyregulatorsofthecellcycle LelandHartwell TimothyHunt PaulNurse 二 细胞周期的检验点1989年 Hartwell通过构建酵母细胞突变模型证实了细胞周期检验点 checkpoint 的存在 并首次提出检验点的概念 细胞周期的运行 是在一系列检验点的严格检控下进行的 它保证前一个事件完成之后 才启动下一个事件 检查点是细胞的错误监测机制 G1 S检验点 在酵母中称start点 在哺乳动物中称R点 restrictionpoint 控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期 相关的事件包括 DNA是否损伤 细胞外环境是否适宜 细胞体积是否足够大 S期检验点 DNA复制是否完成 G2 M检验点 是决定细胞一分为二的控制点 相关的事件包括 所有DNA都正确复制了吗 DNA是否有损伤 细胞体积是否足够大 中 后期检验点 纺锤体组装检验点 所有染色体都排列在纺锤体上了吗 任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上 引起细胞周期中断 三 细胞周期蛋白cyclin的种类繁多 目前从芽殖酵母 裂殖酵母和各类动物中分离出的周期蛋白有30余种 在脊椎动物中为A1 2 B1 3 C D1 3 E1 2 F G H等 分别参与细胞周期中不同时相的调节 分为G1型 G1 S型S型和M型4类 人类细胞周期蛋白线性结构示意图实心方框代表 cyclinbox 方框代表 destructionbox 圆形框代表PEST序列 cyclinbox 各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列 称为周期蛋白盒 cyclinbox 介导周期蛋白与CDK cyclin dependentkinase 结合 Cyclin也含有降解盒 destructionbox 或PEST 脯氨酸 谷氨酸 丝氨酸 苏氨酸 序列 它可以通过定时降解或恒定地迅速周转来调节这些蛋白质的水平 起着CDK的调节亚基的作用 G1期 细胞在生长因子的刺激下 G1期cyclinD表达 并与CDK4 CDK6结合 使下游的蛋白质如Rb磷酸化 磷酸化的Rb释放出转录因子E2F 促进许多基因的转录 CyclinD与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2F G1 S期 cyclinE与CDK2结合 促进细胞通过G1 S限制点而进入S期 向细胞内注射CyclinE的抗体能使细胞停滞于G1期 说明细胞进入S期需要CyclinE的参与 S期 将CyclinA的抗体注射到细胞内 发现能抑制细胞的DNA合成 推测CyclinA是DNA复制所必需的 G2 M期 cyclinA cyclinB与CDK1结合 CDK1使底物蛋白磷酸化 如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩 核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件 M期 在分裂中期当MPF活性达到最高时 通过一种未知的途径 激活后期促进因子APC anaphasepromotingcomplex 负责将泛素连接在cyclinB上 导致cyclinB被蛋白酶体 proteasome 降解 完成一个细胞周期 哺乳动物细胞周期中各时相不同cyclin的作用 四 CDK及其调控CDK即细胞周期蛋白依赖性激酶 cyclin dependentkinase CDK 控制着细胞周期各期之间的顺序转换 CDK是一组相关联的Ser Thr蛋白激酶 酵母中细胞周期的进程主要由单一的CDK P34cdc2 cdc28 所控制 多细胞生物中 细胞周期各期之间的转换需要不同的CDK 脊椎动物的CDK P35 P36的结构与细胞周期蛋白无相似性 1 Cyclin的结合是CDK激活的第一步CDK活性的最初调节者是cyclin亚单位 Cyclin与相应的CDK结合后 引起CDK空间构象改变 暴露其催化亚基 各种细胞周期蛋白程序化的合成和降解保证各对应CDK适时的活化 维持细胞周期的正确时序 2 CDK的磷酸化与去磷酸化以P34cdc2 CDK1 为例 如果对P34cdc2磷酸化作用位点不同 则对该酶的活性分别产生正向和负向的控制 完整的P34cdc2 cyclin复合物需要磷酸化才能被激活 驱动细胞进入有丝分裂 P34cdc2的Thr14和Tyr15的磷酸化引起P34cdc2 cyclin复合物的失活 Weel是催化Tyr15磷酸化的激酶 另有一个是Thr14磷酸化的激酶 催化Thr14及Tyr15脱磷酸化的蛋白磷酸酶为双特异性磷酸酶Cdc25蛋白 P34cdc2的Thr161的磷酸化是酶的活性所必需的 CDKs活化激酶CAK CDKsactivitingkinase 应答Thr161的磷酸化 这是另一种蛋白激酶CDK7 CyclinH复合物 当磷酸酶 1将此位点的磷酸水解 P34cdc2又失去激酶活性 3 CDK抑制剂的作用除了磷酸化 去磷酸化可以调节MPF活性外 另有一类CDK抑制因子 CDCkinaseinhibitor CKI 可与CDK结合抑制其活性 1 Ink4 Inhibitorofcdk4 如P16ink4a P15ink4b P18ink4c P19ink4d 专一地与CDK4 CDK6结合 阻止CDK和cyclinD的结合 使细胞周期不能从G1期的调控点进入到下一个时相 2 Cip Kip包括P21cip1 cyclininhibitionprotein1 P27kip1 kinaseinhibitionprotein1 P57kip2等 能与多种cyclin CDK复合物包括cyclinE CDK2 cyclinD CDK6 cyclinD CDK4结合 抑制cyclin CDK复合物的蛋白激酶活性 使一些细胞增殖所需要的蛋白质磷酸化受阻 细胞停留在G1期 此外P21cip1还可与DNA聚合酶 亚单位PCNA proliferatingcellnuclearantigen PCNA 相互作用 抑制DNA复制 但不影响DNA修复 CDK1的激活需要Thr14和Tyr15去磷酸化和Tyr161的磷酸化 五 生长因子 癌基因和抑癌基因1 生长因子生长因子是促细胞周期运行的重要因子 RTK Ras MAPK信号传递途径是细胞外的信号传递到细胞核内最基本的途径 2 癌基因原癌基因被激活 其编码蛋白大量表达 这些蛋白对细胞周期具有促进作用 癌基因的主要类型及其表达产物 3 抑癌基因抑癌基因可抑制细胞周期于静止期 并使DNA复制不完全或损伤的细胞不能进入分裂期 避免细胞的癌变 1 P53一般情况下 细胞中很少有P53蛋白 DNA损伤会引起P53蛋白浓度和活性的提高 P53蛋白可同P21基因调节区结合 激活P21基因转录 使细胞停滞在G1期的调控点处不能进入S期 这样 即可有足够的时间修复DNA P53蛋白可促进GADD45基因 growtharrestandDNAdamageinduciblegene 表达生成GADD45蛋白 后者与CDK及PCNA形成的复合物 参与DNA损伤的修复 当DNA损伤不能修复时 p53基因的过量表达导致P34cdc2的过早激活 结果使核膜破裂 引起细胞凋亡 2 RbRb基因位于人染色体13q14 由27个外显子构成 分布在总长180 200kb以上的DNA片段上 Rb基因转录的mRNA大小为4 7kb 编码一个分子量为105kD的蛋白质 由928个氨基酸残基构成 定位于细胞核内 是多种cyclin CDK的底物 具有多个被磷酸化的位点 Rb有高 低磷酸化两种状态 低磷酸化的Rb蛋白可与一些转录因子如E2F结合 抑制这些转录因子的活性 阻止细胞的生长 而高磷酸化状态则失去这种功能 使E2F游离 进入核内 发挥转录活性 促进细胞周期进行 Rb在细胞周期内的磷酸化 六 细胞周期与肿瘤 肿瘤细胞最显著的特点是生长失控和幼稚化 即不分化 一 肿瘤细胞周期失控的分子基础1 细胞周期蛋白异常 G1cyclin基因突变 重排 使这些cyclin异常表达 从而使细胞通过G1期 进入S期 细胞即自发增殖 出现转化特征 许多人类肿瘤中 均发现有cyclinD1基因的扩增 B型肝炎病毒 hepatitisBvirus HVB 感染人体后成为导致肝癌的因素之一 有研究发现 HVB基因组整合入cyclinA基因的一个内含子中 产生异常 过量表达的转录物 和正常的cyclinA相比 它缺少N端的 destructionbox 逃脱了对它的降解 大量异常的cyclinA刺激细胞增殖 2 CDK和CKI基因的突变研究中发现肿瘤细胞CDK的水平一般较高 而CKI基因常见纯合性缺失突变 细胞内缺少CKI 或CKI抑制CDK功能的丧失 3 抑癌基因突变不少癌细胞中发现Rb或P53基因发生了突变 使Rb失去了阻断mRNA转录 P53失去了使细胞休止在G1后期的功能 造成细胞周期失控 二 细胞周期与肿瘤的基因治疗1 抑制G1期cyclins的过度表达G1期cyclins反义核酸 在体外和裸鼠体内都可抑制肺癌的增殖 反义DNA可以与基因结合而阻止基因的转录 反义的RNA可与mRNA结合 而抑制其翻译 都可以达到抑制肿瘤细胞增殖的目的 RNA干扰 RNAinterference RNAi 是将双链RNA导入细胞内引起特异基因的mRNA降解的一种细胞反应过程 属于转录后基因沉默的一种 2 促使肿瘤细胞表达正常的CKIs有报道用正常的P16 P21 P27基因与腺病毒载体重组 将重组的腺病毒导入肿瘤细胞 重组的腺病毒在肿瘤细胞内表达有功能的P16 P21和P27蛋白 抑制CDKs的活性 使肿瘤细胞停止在G0 G1 抑制肿瘤细胞增殖 3 抑制E2F的活性把对E2F有高度亲和性的双链DNA片段导入细胞 该DNA能够结合游离状态的E2F生成一种复合物 复合物中的E2F不再与有关基因的启动子结合 从而阻断这些基因的表达 抑制细胞增生 思考题 名词 cyclinbox R点问答 1 简述细胞周期各时相cyclin的种类及作用 2 简述细胞周期的主要检验点 checkpoint 及功能 非洲爪蟾卵细胞发育过程分为六个阶段 和 期 前四个时期为卵母细胞生成和生长阶段 其中第 期时细胞核较大 称为生发泡 germinalvesicle GV 此时细胞就停留在该时期 等待成熟 实验表明 成熟卵细胞的细胞质中必然有一种物质 可以诱导卵母细胞成熟 称之为促成熟因子 maturationpromotingfactor MPF G1期PCC为单线状 因DNA未复制 S期PCC为粉末状 因DNA由多个部位开始复制 G2期PCC为双线染色体 说明DNA复制已完成 与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的早熟凝集染色体 prematurelycondensedchromosome PCC 这种现象叫做早熟染色体凝集 prematurechromosomeconde