药代动力学实验.ppt

药物代谢动力学实验 赵娣中国药科大学药代研究中心2012年10月16日 神农尝百草 传说神农一生下来就是个 水晶肚 几乎是全透明的 五脏六腑全都能看得见 还能看得见吃进去的东西 那时候 人们经常因乱吃东西而生病 甚至丧命 神农为此决心尝遍百草 能吃的放在身体左边的袋子里 介绍给别人吃 不好吃的就放在身体右边袋子里 作药用 不能吃的就提醒人们注意 3 生物样品 药物代谢动力学 定量研究药物 包括外来化学物质 在生物体内吸收 分布 排泄和代谢 简称体内过程 规律的一门学科 常用测定方法 HPLC UV GC MS LC MS MS 数据处理分析 1 HPLC原理与标准操作规程 SOP 2 实验设计与动物实验3 样品处理与方法开发4 定性定量与分析测定5 数据处理与药动学参数计算6 实验报告 实验安排 静注加替沙星在家兔体内的药代动力学研究 HPLC原理与标准操作规程 SOP 1 HPLC的组成2 分配色谱的原理3 色谱柱4 流动相5 定性与定量方法6 样品的预处理7 反相色谱分析方法的开发 HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC的组成 Pump泵Injector Autosampler进样器 自动进样器Column色谱柱Detector检测器DataSystem Integrator数据系统 积分仪表 高效液相色谱系统 高效液相色谱系统 SHIMADZULCMS 2010EV LC MS MSThermoTSQQuantumAccess 分配色谱的分离机理 分配色谱概述 反相色谱的主要类型 基于分子的极性分离洗脱次序 一般为反相 即极性高的先被洗脱常用的流动相 有机溶剂如甲醇 乙腈 水应用添加剂 成为离子对 离子抑制方法常用固定相 碳十八 碳八 胺基等基团反相色谱固定相多为键合相 对HPLC柱的了解 色谱柱分类填料 含碳量 基质 粒径色谱柱的应用正相柱 反相柱 预处理柱色谱柱的规格岛津ShimadzuVP ODS 150L 2 0 5 m 柱号8082693 键合相色谱柱 以硅胶为基质 通过化学键合方式把碳十八 碳八 胺基等基团联在基质上 作为固定相 优点 固定相稳定 不易流失应用广泛 可使用多种溶剂消除硅羟基的不良影响缺点 pH值不能小于3同样填料 各种牌号色谱柱不尽相同 反相C18色谱柱的活化 步骤一 90 甲醇1mL min流速冲洗30min步骤二 10 甲醇1mL min流速冲洗30min步骤三 90 甲醇1mL min流速冲洗60min 色谱柱的存放 存放前的处理除去杂质 盐 合适的存放溶剂避免色谱柱床的干枯避免机械震动防止细菌生长注意存放的温度 液相色谱对流动相的要求 除色谱柱对流动相对的要求外 还有 与检测器匹配脱气避免卤素离子 不锈钢系统 溶剂的粘度细菌的生长 流动相的脱气 流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确 并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定 信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化 流动相脱气的方法 加热简单 如同抽真空一起使用 其效果很好 但容易造成流动相组成的变化抽真空同上 一般在溶剂抽滤的同时 也有脱气的效果超声波简单 但效果不理想 通惰性气体 一般用氦气 可保持连续脱气 多用于低压梯度脱气机可保持连续脱气 多用于低压梯度 色谱峰定性 鉴别每个色谱峰通过比较保留值 通常是保留时间 的方法 找到各色谱峰所对应的组份大多数情况下用比较保留时间来定性即所谓 保留时间相同 可能是同样的组份保留时间不同 肯定不是同样的组份 用保留时间定性 用 标样 的保留值定出被测组份的位置 标准加入法举例 废水样品中五氯苯 PCP 的分析 PCP 4ppm 3ppm 2ppm 1ppm 常用的定量方法 峰面积百分比法由于检测技术的影响 在液相色谱中不常用外标法在液相色谱中用的最多内标法准确 但是麻烦在标准方法中用的最多 外标法定量 配制一系列已知浓度的标样 外标法定量 二 实际色谱图 标准曲线 内标法定量 一 配制一系列浓度的标样 其中加有内标样 内标法定量 二 实际色谱图 标准曲线 内标法定量 三 对内标物的要求化学结构与待测组分相似 同系物 异构体 在样品中不存在不与样品中组份发生任何化学反应保留值与待测组分接近浓度 响应值 与待测组分相当其色谱峰与其他色谱峰分离好 可接收的检测范围 校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效 高或低于这些点都可能引起计算错误 样品的预处理 样品预处理的目的除去微粒减少干扰杂质浓缩微量的组份提高检测的灵敏度及选择性改善分离的效果有利于色谱柱及仪器的保护 样品的预处理重要性 占样品分析时间的比例样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间占分析的消耗总成本最大消耗大量的溶剂及其他化学品实验的重复性及准确性最差的环节影响实验结果好坏的最重要因素是决定性的步骤 样品预处理常用的方法 高速离心过滤 超滤选择性沉淀衍生反应液 固萃取 液 液萃取Sep Pak样品处理小柱其他 选择性沉淀 常用于生化样品中除蛋白有机溶剂乙腈 甲醇强酸三氯乙酸 过氯酸盐50 硫酸铵10 TCA 样品分析时第一步干什么 想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品 或有否类似样品的分析方法查文献 如CA 化学文摘 仪器制造商的文献 如Waters对色谱柱有足够的了解掌握分离机理 自己开发方法充分了解您自己的样品 分析时要了解哪方面的情况 灵敏度的要求有多高 样品的本底是否很复杂 有多少组份要分析 对分析的精确度 准确度等有多高要求 是否因是日常检验 而要求方法容易使用 使用文献方法 色谱柱填料的种类 品牌是否相同 注意文献方法的流动相是否损害色谱柱 如色谱填料品牌不同 需要调整流动相注意色谱柱的规格 内径 柱长需要调整流速 进样量注意梯度条件了解系统的滞后体积 梯度 反相色谱的方法开发 开发过程实例色谱条件 色谱柱 C18 4mm 30mm流动相 乙腈 水 不同的溶剂强度 60 40 50 50 40 60 由强渐弱流速 2ml min样品 对羟基苯甲酸甲酯 MethylParaben 对羟基苯甲酸丙酯 PropylParaben 对羟基苯甲酸丁酯 ButylParaben 改变流动相比例 谱图 改变流动相组成 通过改变流动相改变选择性同样强度的不同溶剂改变色谱柱 离子型化合物的分离方式 使用离子交换柱 离子交换法主要用于 强 阴 阳离子使用反相柱离子抑制色谱法通过改变流动相的pH值 使样品成中性离子对色谱法加入 对离子 使样品呈中性 离子抑制色谱 离子型化合物在反相色谱柱上不保留改变流动相的pH值 抑制样品离子的电离适用于弱酸性化合物的分离降低流动相的pH值 使样品降低离子化使用硅胶基质C18填料使用条件应在填料基质的范围内硅胶柱的pH在2 8 较保险值3 7 内 常用缓冲液及其pH值 离子抑制色谱实例 在乙腈 水及pH 7时 多数保留时间很短 无法完全分离 其他精密仪器操作标准操作规程 SOP 要点 高速冷冻离心机 配平 十字交叉 样品选择普通离心机 配平 十字交叉 样品选择万分之一电子天平 称量量程范围 记录 保养紫外可见光分光光度计 预热 样品量 校准涡旋振荡器 涡旋程度超声机 超声效果 时间 药代动力学实验室的要求 1 环境的要求 灰尘 湿度 阳光是分析仪器的大敌2 所写即所做3 分析测定用试剂为色谱纯及以上 水为超纯水4 痕量分析对实验人员有较高要求5 对仪器设备的操作严格按照SOP执行 专人管理和维护保养6 良好的实验习惯 HPLC UV测定