L05077罗国平

项目类别项目批准号附件3 华南农业大学大学生科技创新活动项目结题书项目名称： 酸性蛋白酶的化学修饰与性质研究 申 请 人： 罗国平 蒋依依 彭晓瑜 所在院部： 生命科学学院 专业年级： 2003级生物科学（2）班 联系电话： 38676752指导教师: 赵赣 职称 副教授 立项日期： 二五 年 四 月 二十 日 结题日期： 二六 年 四 月 六 日华南农业大学大学生科技创新活动项目指导中心 填 表 说 明 一、 填写结题报告书前，请先咨询指导教师或有关专业教师。申请书的各项内容要求实事求是，逐条认真填写。表达明确、严谨，一律要求用打印稿件。 二 、申请书为A4复印纸，于左侧装订成册。一式三份（至少一份原件），由指导教师和所在院（部）审查并签署意见后报大学生科技创新活动项目指导中心。三 、一级标题三号宋体加粗，用“一、二、三”标示；二级标题四号楷体加粗，用“（一）（二）（三）”标示；三级标题四号仿宋加粗，用“1、2、3”标示；四级标题四号仿宋，用“”标示。示例：一、XXXX课题立项与研究的目的意义（一）XXXX课题立项与研究的目的的意义1、XXXX课题立项与研究的目的意义XXXX课题立项与研究的目的意义四、如表格不够，可以加附页。一、简表项目简况项目名称酸性蛋白酶的化学修饰与性质研究项目类别 B、理科类申请经费1500元起止年月2005.52006.4项目组成员姓 名性别出生年月年级专业班级所在学院上学年综合测评分项目中的分工本人签字罗国平男1983.1103级生物科学（2）班生命科学学院72.02蒋依依女1985.02同上同上80.95彭晓瑜男1984.06同上同上67.52指导教师情况姓名赵赣性别男学位博士研究生职称副教授研究方向生物化学与分子生物学授课名称动物生物化学、基础生物化学（生物技术专业与非生物技术专业）、分子生物学、高级动物生物化学（兽医学院研究生）项目简介生物酶是一类分子适中的蛋白质，存在于活细胞中，是一种天然高分子催化剂。目前工业使用酶制剂时还存在一些缺点，如稳定性差、使用效率低，难以在有机溶剂中使用，寿命不长等，使得使用酶的成本升高。酶的化学修饰就是利用化学方法将某些化学物质或基因结合到酶分子上，改变酶的理化性质，最终达到改变酶的催化性质的目的，提高其生物活性，增强在不良环境下的稳定性，降低生物的抗原性。酸性蛋白酶可以在酸性条件下水解蛋白质，在酿醋、酿酒、皮革制造及畜牧业中有广泛的应用价值，而近十几年来对酸性蛋白酶的修饰方面的研究又不多见。本项目主要研究聚乙二醇、-环糊精、肝素、月桂酸等对酶的化学修饰，研究修饰前后酶的最适温度、最适pH值、Km等的变化，以及研究修饰前后酶对温度、酸碱度、高浓度SDS、脲素等因素或物质的耐受性的研究，从而了解如何提高其酶活性，如何增强酶对不利因素的耐受能力，为酶的应用提供实验依据。二、项目研究的内容与方法以聚乙二醇或肝素、月桂酸、-环糊精等为修饰剂，修饰一从微生物分离提取到的酸性蛋白酶，研究修饰前后酶的最适温度、最适pH值、Km等的变化，以及研究修饰前后酶对温度、酸碱度、高浓度SDS、脲素等因素或物质的耐受性的研究，从而了解如何提高其酶活性，如何增强酶对不利因素的耐受能力的规律，为酶的应用提供实验依据。首先用NBS对不同浓度的酸性蛋白酶进行色氨酸残基的修饰，利用Spade等人介绍的分光光度计法，利用吲哚被氧化后在280nm吸光度的降低来计算被氧化修饰的色氨酸残基的量。SDS凝胶电泳鉴定修饰产物。同样用IAA进行色氨酸残基的修饰；用DEPC对组氨酸残基进行修饰；用PEG与马来酰亚胺偶联，添加芳香族化合物作spacer，修饰酶的巯基；用PEG偶联活化为单甲氧基聚乙二醇即mPEG，来修饰上述的酶，并测量该酶的活性。三、项目研究过程与资料查阅情况由于实验条件和经费的限制，我们在实验过程中遇到了不少困难，因此对原有实验方案做了适当的改动。在研究过程中我们主要参考了以下材料：1黄志锋 郑 青* 苏志坚等 聚乙二醇定位修饰haFGF突变体 化学通报2004年第67卷2刁颖辉 付时雨* 余惠生 生物酶的固定化及其应用 化学通报2002年第65卷3姜忠义 许松伟 吴 洪 天然产物的酶法结构修饰 有机化学 2002年第22卷第3期，2202264杨缜 聚乙二醇修饰对酶活性和稳定性的影响 生物化学与生物物理进展 1995.22.3403455母敬郁 麦荫乔 李小梅等 甲基化聚乙二醇修饰超氧化物歧化酶的研究 白求恩医科大学学报 1995年第21卷第2期6张雅丽 王凤翼 宋世廉等 蛋白质酶法修饰的初步探讨大豆和芝麻蛋白的合成类蛋白营养评定 食品与发酵工业 1994.57姜怀春 李 宏 脂肪酶的化学修饰和磁性化及其应用潜力 重庆教育学院学报 2000年9月13卷第3期8刘建忠，宋海燕，翁丽萍，计亮年 化学修饰改进酶的催化特性研究进展 分子催化 2002年12月第16卷第6期9马晓建，吴 勇，祝春进，赵银峰 化学修饰酶的研究进展 化学与生物工程 2004 No.610何忠效 主编 生物化学实验技术 化学工业出版社 2004年3月由于参考文献过多，仅列举出上述对实验有指导意义的文献。同时通过网络查找了不少资料，并在赵赣老师的悉心指导下，我们对研究方案作了如下的改动：选用的修饰剂主要有N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、双乙酰、聚乙二醇（PEG）、丁二酸酐、乙酰丙酮、硫代乙醇酸钠。选用一定的pH值， 在一定温度下用不同浓度的修饰剂对不同浓度的酶进行修饰，然后用分光光度计测定酶活性。再选出合适的修饰剂，在不同的pH值下对不同浓度的酶进行修饰，再测定其酶活性。从而找出酶的最适pH值，最适的修饰剂浓度。四、项目成果完成形式和价值通过对酸性蛋白酶进行修饰，研究修饰前后酶的有关性质的变化，探讨酶学修饰方法的利弊，而且了解了如何提高其酶活性、如何增强酶对不利因素的耐受能力的方法，为酶的应用提供实验依据。从本次实验的实验结果得到的结论是修饰的作用不大，即修饰的专一性不够强，虽然在一定的浓度范围内，对酶的活性有一定的影响，但是总体效果不好，从修饰前后紫外吸收值的差异以及同一平行管的实验中的活性相差过大中可以体现。部分修饰剂对酶活性有一定的提高，如丁二酸酐。可通过改变实验的方式，进行进一步的研究。再者，由于无法对酶结构进行一定的研究，无法进行所谓的定向修饰，只能通过不同浓度及不同的修饰进行对比。对于上述的实验结果，可以对以后酶的定向改造提供一定的参考，通过不同化学试剂的尝试，可以为后面的工作节省一定的时间和资源。由于部分试剂价格过于昂贵，课题的资金无法全部用于试剂的买进，故只是争取作能够争取到的试剂。五、经费使用情况全部用完。六、申请人对该项目研究工作完成后的认识总结实验准备阶段的时候，是在前人的基础上，通过酶的定向修饰的研究，对酸性蛋白酶进行修饰，通过对酪蛋白的催化、分解活性，对紫外275nm，分解的蛋白的氨基酸的多少来进行一定的数据对比。并想借助一定的仪器对该酶的结构进行一定的分析。实验过程中，由于经费有限，特别是聚乙二醇的价格过高，无法进行试验对比。因此用了一系列包括不知道或知道其修饰的功能基因地试剂，以不同的酶浓度和不同的pH值来观察。在整个实验中，我们学会了团结合作的精神，合理分配好三个人的实验时间，并进行一定时间的交流，不断改进实验方案，以求做出最后的效果。再者，提高了我们的实验技能以及对实验仪器的熟练度，并对该学科大发展有了更深层次的理解。体会了科学研究的艰辛及严谨。赵老师在实验的过程中给予来我们很多的意见，对于我们实验中的不足提出来自己独到的看法，对实验的进行及完成有很大的帮助。七、指导教师对项目完成情况的意见本课题的参与者在学习任务较重点情况下，能够积极地参与此创新项目的研究工作，获得了初步的结果，并对自己以往的学习进行了反思。这无疑是有积极意义的。从这一年的创新项目的实施过程来看，项目的是申报内容不宜过多，应将学生能够完成作为衡量的标准之一。因