基因工程 考试重点.doc

1.简述基因工程四大要素的作用及基因工程操作步骤目的基因、运载体、工具酶、受体细胞 1.获取目的基因 2.基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合） 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因导入受体细胞后，检测与鉴定是否可以稳定维持和表达其遗传特性2.构建cDNA基因文库基本过程是怎样的a.细胞总RNA的提取和mRNA分离 b.第一链cDNA合成 c.第二链cDNA合成 d.双链cDNA克隆进质粒或噬菌体导入宿主细胞进行繁殖3.基因工程中常用的酶类有哪些，有何作用限制性核酸内切酶 基因的剪刀连接酶 连接DNA分子聚合酶 合成DNA分子修饰酶 甲基化酶4.基因工程在生产实践中有何应用农业：抗逆性转基因植物 农药生产 医学：基因诊断 基因治疗 抗生素环境：环境监测 净化污染5.关于转基因生物的争论（1）转基因生物可能对环境质量、生态系统或生态系统的稳定性产生不利影响。（2）转基因生物可能对人体健康产生不利影响，严重的可以致癌和其他遗传病。（3）基因武器可能给人类带来毁灭性的危险。6.影响DNA连接反应的因素有哪些连接缓冲液 pH ATP浓度 连接温度与时间 酶浓度 DNA浓度7.重组子的筛选与鉴定有哪些方法遗传检测法（平板筛选） 分子检测法（PCR） 物理检测法（电泳） 免疫化学检测法 核酸序列分析8.目的基因制备方法从细胞核中直接分离 限制性内切酶酶解 人工体外合成 逆转录酶制备cDNA9.重组DNA技术中最常用的运载目的基因的载体是什么常用的运载体主要有两类:一类是质粒,它是存在于细菌或酵母菌细胞质中的一类小型环状DNA分子,结构简单,独立于染色体或拟核之外,具有自我复制能力.另一类是病毒,包括植物病毒 动物病毒 噬菌体10.基因工程的克隆载体必须具备的条件？（1）有复制起点（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点（3）具备合适的筛选标记（4）具备合适的拷贝数目（5）分子量要相对较小（6）在细胞内稳定性要高（7）易分离纯化11.载体的克隆原理和步骤1、通过裂解过程增殖载体。2、载体与外源DNA的酶切。载体一般要纯化左路、右臂，并进行去磷酸化处理。3、外源DNA与载体的连接，形成的是多联体。4、重组噬菌体的体外包装，需要单独制备衣壳蛋白，包装过程对DNA大小有选择性。5、包装后的噬菌体颗粒感染大肠杆菌，经过的复制、包装和裂解过程，重组载体得到扩增，一个的感染和扩增会导致它周围一圈范围内的大肠杆菌被溶解，形成透明的溶菌圈/噬菌斑。6、筛选。每个噬菌斑代表了一个重组，所有噬菌斑的集合就为一个文库。12.受体细胞应具备的条件是什么？1、便于重组DNA分子的导入。2、便于重组体的筛选。根据所用的表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因是否相匹配，从而易于对重组体进行筛选。3、遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密度发酵而不影响外源基因的表达效率。对动物细胞而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。4、受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达。5、安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。一般选用致病缺陷型的细胞或营养缺陷型细胞作为受体细胞6、能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。从受体细胞的角度出发，通常的做法是是对其作适当的修饰改造，如选用某些限制性核酸内切酶缺陷型的受体细胞就可以避免其对重组DNA分子的降解破坏作用。7、受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。8、具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基因的高效表达。9、在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。13.天然DNA来源:染色体DNA。 病毒和噬菌体DNA。质粒DNA。 线粒体和叶绿体DNA。14.转基因技术的几个主要步骤？（1）分离能够编码所需产物的DNA片段（2）将目的基因克隆到适当的载体DNA中形成重组DNA，并且连接了一个控制目的基因转录表达的启动子和一个控制目的基因转录终止的终止子，还连接了一个标记特殊蛋白质的标记基因（3）利用细菌繁殖扩增重组DNA(4)利用基因枪、农杆菌等方法将连接了启动子和终止子的目的基因导入到目标植物的细胞中（5）筛选含有外源基因的转化细胞，并诱导产生转基因植株（6）转基因植株大规模种植。15.目的基因与启动子拼接后，重组分子若不表达，应如何分析？A.目的基因的表达方式分：细胞内表达或者分泌产物至细胞外，如果蛋白为分泌性，那么细胞内检测不到表达，或者表达很少；B.分子量大小，分子量大小决定了蛋白半衰期，因而检测需要延长；C.目的基因的抗体特异性不好则很难以检测表达；D.许多表达宿主自身有自己的蛋白酶，会将所需产物降解，也可能因为修饰系统不同，使得产物的活性不高或者没有；E.如果宿主菌与蛋白来源菌不同也有可能由于密码子使用偏好性不同导致不表达16.基因工程的理论基础：. 明确了遗传信息的携带者基因的载体是DNA，明确了遗传的物质基础。. DNA分子的双螺旋结构和半保留复制模型得以阐明，解决了基因的自我复制和传递问题。. 中心法则、操纵子学说的提出以及遗传密码子的破译，解决了遗传信息的流向和表达问题。(4). 遗传物质基础和中心法则的通用性决定了基因工程原理和技术在生物界普遍适用，尤其是可以实现跨越任何物种界限的遗传成分转移。17.基因工程的技术基础：. DNA体外切割和连接技术。 . 克隆载体的发展与应用。. 大肠杆菌转化体系的建立。. 琼脂糖电泳技术的应用。. DNA测序技术的应用。. 核酸杂交技术的应用。18.碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA原理碱裂解法由Birnboim和Doly设计并于1979年发表，基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。19.PCR引物的设计一般原则（1.）引物长度一般以1830bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。（2.）解链温度(Tm值)很重要，直接决定了扩增中可使用的退火温度(Ta值)的高低，较高时特异性增加，但退火效率下降，过低时退火效率较高，但特异性下降。两条引物间的Tm值越接近越好。计算Tm值的方法很多，简易公式为Tm=4(G+C)+2(A+T)，适于短于20nt的引物。长引物的Tm值计算公式见书，但比实际值往往偏低（3.）避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。（4.）要避免两个引物间特别是3末端碱基序列互补以及同一引物自身3末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发夹结构。（5.）G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在4060%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。（6.）引物3末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3末端为G、C或T时引发效率较高，但3要避免较密的C+C或G+C连排。（7.）引物5末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。（8.）引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。20.PCR过程：模板DNA的变性：模板DNA经加热至95左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。21.基因文库的质量标准 1、重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力； 2、载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆 3、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序和染色全步查； 4、克隆片段易于从载体分子上完整卸下进行亚克隆； 5、重组克隆能稳定保存、扩增和筛选，文库繁殖后失真度小。22.cDNA文库的特征和发展1）cDNA只含有对应于成熟mRNA的转录区，不含启动子、终止子、内含子、基因间隔区等。2）cDNA一般较短，平均长度1.5kb左右，多数为100bp至10kb。3）表达谱的时空动态性决定了cDNA文库的多样性。4）不同基因的cDNA间存在丰度上的差异。22.基因组工程与基因工程的差异23.通过试剂盒分离纯化大肠杆菌质粒DNA 24.影响电泳迁移的主要因素：DNA的大小DNA的构象琼脂糖浓度 缓冲液：乙酸盐缓冲液(TAE)、硼酸盐缓冲液(TBE)、磷酸盐缓冲液(TPE)。25.琼脂糖凝胶电泳的操作过程A、缓冲液制备B、EB母液配制C、将点样梳洗净干燥放入胶板中D、琼脂糖胶板的制备：E、加样和电泳F、取出凝胶，置于紫外投射仪上，调好相机焦距拍照26.探针标记方法：1）PCR标记：采用PCR扩增的方法将放射性或非放射性标记的dNTP整合进入双链PCR产物中。 2）随机引物标记：采用短链随机引物指导探针DNA的合成，并完成标记的掺入。3）缺口平移标记：采用DNase和DNA聚合酶进行探针合成，完成标记的掺入。4）末端标记：采用末端转移酶（TdT）或多核苷酸激酶向DNA末端添加标记性的核苷酸，完成标记的掺入。5）化学合成法标记：采用化学合成法合成探针的同时完成标记的掺入，常用在寡核苷酸探针的合成上。6）体内合成标记：将探针模板克隆到M13噬菌体或其它载体上，在大肠杆菌体内合成标记性的RNA或DNA探针。27.PCR反应体系（1.缓冲液（2、脱氧三磷酸核苷（3、引物PCR （4、模板 （5、耐热性的DNA聚合酶28.PCR技术的应用研究 基因克隆，DNA测序，分析突变诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医 犯罪现场标本分析肿瘤 各种肿瘤检测其他29.寡核苷酸介导定点诱变的基本流程（1）化学合成能与野生型DNA模板的靶区域退火，并携带所需突变的寡核苷酸，作为体外合成DNA的引物。（2）由DNA聚合酶根据模板序列延伸寡核苷酸，产生含有预定突变的双链DNA。（3）对突变体DNA进行测序，验证靶点的突变，并确保其他区域没有发生额外的突变。30.诱变寡核苷酸的设计要求与靶DNA的适当链互补，并注意与模板的其他区域不能错误杂交；足够的长度与靶序列特异地结合，1-2个碱基改变的引物要求至少25个碱基长度；错配碱基位于中央位置，使每侧有10-15个碱基与模板链完全匹配；含有与模板完全杂交的5端区，这样从上游引物起始的DNA合成不至于取代诱变寡核苷酸引物；诱变寡核苷酸引物3区域有10-15个碱基与模板链完全匹配，形成足够稳定的杂交分子；无回纹、重复或自身互补序列； 必要时可在诱变寡核苷酸上加入新的酶切位点，或消除靠近诱变点的已有酶切位点。31.基因文库的质量标准 1、重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力； 2、载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆 3、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序和染色全步查； 4、克隆片段易于从载体分子上完整卸下进行亚克隆； 5、重组克隆能稳定保存、扩增和筛选，文库繁殖后失真度小。32.基因组DNA文库的构建流程1、基因组DNA的制备2、基因组DNA的切割3、载体和受体的选择与制备4、连接重组、包装、转化/染5、文库的质量检测33.基因克隆的筛选策略一、表型筛选法二、杂交筛选和PCR筛选三、免疫筛选四、酵母双杂交系统34.植物基因工程的基本路线1 从供体生物分离克隆目标基因2 构建工程载体3 转化大肠杆菌和重组载体的分子鉴定4 获得农杆菌工程菌株及植物转化5鉴定及筛选转基因植株6转基因植物的安全性评价和产业化35.转基因动物的应用1、大幅提升畜禽重要经济性状表现力。2、增强畜禽抗病力，推动健康养殖业发展3、转基因动物将成为特种蛋白因子开发的最佳模型4.动物基因工程器官将为挽救垂危病人生命和延长人类寿命做出巨大贡献5.动物基因工程已成为生命本质正确解析和疾病发生机理探索的