分子生物学常考大题.doc

l 真核基因组的基本结构特点？答：有一定的染色体数目，体细胞一般为双倍体远大于原核基因组，结构复杂，数目庞大每个基因都由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子含大量重复序列，非编码区占90%以上真核基因是断裂基因，编码区被非编码区分隔开功能相关的基因构成基因家族l 什么是基因突变，基因突变的意义？答：1、指一个或者多个脱氧核糖核苷酸的结构、复制或表型功能的异常变化，即DNA损伤2、意义：突变与遗传的保守性是对立而又统一的自然现象突变是进化、分化的分子基础突变造成了基因多态性：如突变发生在蛋白质的非功能区域上，氨基酸的改变不影响蛋白质功能致死性突变突变是某些疾病的发病基础l 试述乳糖操纵子是如何根据环境条件调整表达状态的？答：葡萄糖存在、乳糖不存在：此时无诱导剂存在，阻遏蛋白与DNA结合。而且由于葡萄糖存在，CAP也不能发挥正调控作用，基因处于关闭状态葡萄糖和乳糖都不存在：在没有葡萄糖存在的情况下，CAP可发挥正调节作用，但没有诱导剂，阻遏蛋白的负调控作用使基因仍然处于关闭状态葡萄糖和乳糖都存在：乳糖的存在对基因的转录起诱导作用。但由于葡萄糖的存在使细胞内cAMP水平降低,cAMP-CAP复合物不能形成，CAP不能结合到CAP结合位点上，致使RNA聚合酶不能与基因结合，转录不能进行，基因仍处于关闭状态葡萄糖不存在、乳糖存在：此时CAP可以发挥正调控作用，阻遏蛋白由于诱导剂的存在而失去负调控作用，基因被打开，启动转录l 何谓PCR-RFLP和PCR-SSCP，简述两者的基本原理和操作过程，并简要讨论两种基因诊断技术的应用特点和各自的优缺点？答：1、PCR-RFLP：聚合酶链反应限制性片段长度多态性。基本原理：一些突变发生在限制性核酸内切酶的识别位点上，如果用相关的限制性核酸内切酶切割基因组DNA，就产生长度不同的片段。操作过程：目的基因的扩增扩增片段的酶切酶切产物的电泳多态性的确定。2、PCR-SSCP：聚合酶链反应单链构象多态性。基本原理：单个或多个碱基突变可能影响单链核酸分子的构象，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，不同构象的核酸分子常表现不同的迁移率，电泳新生条带的出现反映了突变分子的存在。操作过程：目的基因的扩增扩增片段的变性变性基因片段的电泳正常和异常电泳带的确认DNA测序的证实。3、两者比较：检测目的：突变、多态性电泳样品：双链、单链检测范围：限制性内切酶识别位点、扩增的DNA片段全长扩增片段的要求：限制性酶切位点、200400bp之间测序的难易：较为简单、较为复杂DNA测序的依赖：不需要、需要l 简述基因治疗的基本条件和过程？答：基本条件：基因诊断明确现行治疗方法无效或欠佳相关基因克隆、载体的构建和基因转移等技术已相当成熟较低的表达水平可以治疗疾病基因转移有效性和安全性的确定。过程：病例的选择基因诊断目的基因的获取、扩增靶细胞的选择与分离载体的选择与构建目的基因与载体的连接基因转移疗效的观察与确定l 简述重组DNA技术的基本步骤？答：获取目的基因克隆载体的选择外源基因与载体的连接重组DNA导入受体菌重组体的筛选克隆基因的表达l 简述核酸探针的概念和种类？答：1概念：能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸序列。2种类：基因组探针、cDNA探针、RNA探针、寡核苷酸探针l 细胞周期调节关卡？答：G1-S关卡 当G1早期，Rb蛋白未磷酸化时，与E2F结合构成复合物抑制E2F的转录活性激酶由ATP提供磷酸基，使Rb磷酸化，与E2F解离。E2F影响结构基因的转录表达，其影响作用表现为使cyclingE表达增加DNA聚合酶表达增加DNA修复酶表达DNA合成原料相关酶的表达因此，细胞周期从G1期进入S期要看E2F是否解离，解离才能从G1期进入S期。P21对cyclinD-CDK4/6，cyclinE-CDK2有抑制作用，阻止E2F解离表达为抑癌状态；Ras则促进上述复合体的活性，促进E2F解离，使细胞周期从G1期转化到S期，表达为无抑癌状态 S期关卡 短暂，没有“维持成分”DNA损伤后仍需要合成染色体以提供同源重组有效修复的模板 长期s期停滞可能使已经启动的复制起点再次获得复制能力 ATM-Chk2-CDC25A-CDK2-CDC45是短暂的s期反应的关键机制 G2-M期转折 CDK1-CyclinB1/B2参与和完成有丝分裂 M期纺锤体组装关卡 有丝分裂纺锤体组装不完全，就会防止APC多泛素化系统的激活，导致细胞分裂后期停滞 有丝分裂纺锤体关卡与MPF活性调节相关。l 凋亡细胞的基本特征？答：形态学特点：正常细胞群中单个细胞死亡胞浆空泡出现，膜发泡，空泡排出伴随水分丧失，细胞容积减少，细胞密度增加，细胞固缩染色质浓缩线粒体等细胞器浓缩，细胞核解体形成调往小体。生物化学特点：非随机性DNA降解细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻正常的能量代谢胞浆蛋白交联l 简述蛋白质是如何相互作用来调节CDK活性的？答：CDK即周期蛋白依赖性蛋白激酶，在细胞周期进程中作为催化亚基发挥作用，必须与细胞周期蛋白结合才具有活性，以磷酸化发的形式作用于细胞周期事件参与DNA合成的启动终止，M期事件为对细胞G1-S期和G2-M期的过渡进行调控。细胞周期蛋白与CDK结合形成Cyclin/CDK复合物，作为复合物中的调节亚基，实现对细胞周期调节作用。CKI是CDK抑制因子直接与CDK或CDK/Cyclin复合物结合，抑制CDK活性，阻断或延迟细胞周期运行l 基因表达调控的生物学意义？答：适应环境、维持生长和繁殖维持个体发育与分化l 试述当培养液中提供了足够的色氨酸时，色氨酸操纵子是如何降级表达的？答：衰减子位于一些操纵子中第一个结构基因之前，是一段能减弱转录作用的顺序。色氨酸操纵子的衰减子位于L基因中，当细胞内色氨酸增多时，结构基因转录受到抑制，但L基因转录的前导mRNA并没减少，这部分转录物称衰减子转录物，其具有4段特殊的序列，片段1、2、3、4。片段1和2，2和3，3和4能配对形成发夹结构，形成的强弱为片段1/2片段2/3片段3/4。片段3/4形成发夹结构后，接着是寡尿嘧啶，是转录终止信号。这4个片段形成何种发夹结构是由L基因转录物的翻译过程所控制的。L基因的部分转录产物含两个相邻的色氨酸密码子。L基因转录后不久核糖体就与mRNA结合，并翻译L短肽序列。细胞内有色氨酸时，形成色氨基酰-tRNA，核糖体翻译可通过片段1和2。因遇到翻译终止密码，核糖体到达片段3之前便从mRNA上脱落。在这种情况下，片段1/2和片段2/3之间都不能形成发夹结构，而只有片段3/4形成发夹结构，即形成转录终止信号，从而导致RNA聚合酶作用停止。l 列出DNA复制的基本反应体系并说明各个组分的基本功能？答：底物：dATP、dGTP、dCTP、dTTP，功能：提供复制所需原料酶类及蛋白因子：解链酶（使双螺旋DNA解旋和解链）拓扑异构酶（释放旋转张力，松解DNA超螺旋）单链结合蛋白（维持模板处于单链状态）引物酶和引发体（合成RNA引物）DNA聚合酶（以DNA为模板，合成互补的DNA新链，即时校读，切去错配的核苷酸，水解RNA引物）DNA连接酶（连接互补双链DNA中单链缺口两端相邻的DNA片段l 转录起始过程的要点？答：基本过程：RNA聚合酶结合在转录模板起始区域；DNA双链解开，使其中一条链作为模板，开始转录原核：RNA聚合酶有4种（5个）亚基：2、。亚基又称因子，2、构成核心酶，核心酶与因子组成全酶，因子的作用是识别并结合DNA模板上启动子的-35区，然后与核心酶形成全酶在启动子-10区启动转录真核：TFD识别并结合相应基因的启动子中的TATA盒，然后TFA、TFB、RNApol/ TFF、TFE、TFH等依次结合，形成起始复合物。TFD是唯一能结合TATA盒的蛋白质，真核生物RNA聚合酶不与DNA直接作用，需借助转录因子与TATA盒结合，再开始转录l 何谓基因，简要说明基因与疾病的关系？答：基因：具有遗传效应的DNA片段。基因与疾病：关系：除外伤疾病，其余都为环境与遗传相互作用的结果单基因遗传病单基因变异导致的遗传病，如：苯丙酮尿症多基因遗传病，如糖尿病癌基因的激活，抑癌基因的丢失或失活与肿瘤的发生、发展有关。l PCR-RFLP的应用特点与优缺点？答：操作简单，结果可靠，便于应用该方法只能用于筛查影响内切酶识别序列有关的多态性部位，不能发现与其识别无关的部位的改变该方法局限性确定该方法主要应用于已知突变有和无的确定与基因多态性的筛查l PCR-SSCP的应用特点与优缺点？答：可用于长度和双链电泳率基本或完全相同，仅仅含有一个或几个可能的点突变的扩增片段的检出其检出率与扩增片段长度有关，扩增片段太短无疑大大降低了检测的效率，提高检测成本；扩增片段太长则降低了突变的检出率，一般在200400bp间l 基因工程常用工具酶？答：限制性核酸内切酶、DNA聚合酶2、DNA连接酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端转移酶l 载体选择标准？答：具有自主复制能力，以保证重组DNA分子可以在宿主细胞内得到扩增具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开，便于分离提纯分子量相对较小，易于操作，并有足够的接纳目的基因的容量在非宿主功能必需的DNA区段有较多的单一限制性核酸内切酶位点用于目的基因的克隆有一个或多个筛选标记具较高的遗传稳定性l DNA序列分析有哪些方法？答：化学裂解法DNA链末端合成终止法l 简述DNA链末端合成终止法的原理？答：利用四种2,3-双脱氧核苷酸（ddNTP）代替部分脱氧核苷酸（dNTP）作为底物进行DNA合成反应，一旦2,3-双脱氧核苷酸参入到合成的DNA链中，由于核糖的3位碳原子上不含羟基，不能与下一个核苷酸酸反应形成磷酸二酯键，因此合成反应终止l 探针标记的方法分哪两类？各如何检测？答：放射性同位素标记；检测：放射自显影或计数非放射标记；检测：通过抗原-抗体免疫反应偶联，然后再与显色体系显色检测l 探针的放射性同位素标记方法有哪几种？答：缺口平移法随机引物法DEA的5末端标记法l 探针的非放射性同位素标记方法有哪几种？答：光敏生物素标记，如光生物素酶促生物素标记DNA半抗原标记，如地高辛酶标，如AP（碱性磷酸酶）、HRP（辣根过氧化物酶）l 核酸的分子杂交技术分哪两类？答：液相分子杂交固相分子杂交l 什么是核酸的固相份分子杂交？有哪几种？答：概念：将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，而标记的探针则游离在溶液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，有原位杂交及斑点杂交l 细胞周期调控的主要分子机制？答：细胞周期蛋白：在细胞周期的进程中作为调节亚基发挥作用细胞周期蛋白依赖性激酶：在细胞周期进程中作为催化亚基发挥作用，必须与细胞周期蛋白结合时才具有活性，与周期性合成的细胞周期蛋白结合后，以磷酸化/去磷酸化的形式直接作用于细胞周期事件，参与DNA合成的启动/终止，M期事件等，对细胞G1S期和G2M期的过程进行调控细胞周期蛋白激酶抑制因子：直接与CDK结合，抑制其活性，阻断或延迟细胞周期运行l 研究细胞周期调控的实验体系？答：流式细胞仪技术 测定细胞DNA含量提示其所处的细胞周期时相 细胞融合实验 证明 CDK复合体控制进入细胞周期的S期和M期 互补实验 筛选编码细胞周期调控蛋白的基因l 细胞周期蛋白-激酶的抑制因子（CKI）有哪些？答： INK4家族的CKI：p15/p16/p18/p19 CIP/KIP家族的CKI：P21/P27/P57 新的CKI-14-3-36l 细胞周期与癌症？答：Rb与E2F E2F在正常细胞和肿瘤细胞中对细胞增殖都很关键 至少1/3的人类肿瘤中有Rb基因的缺失或突变 P27的功能 P27蛋白石CKI，能抑制G1期CDK-Cyclin复合体活性而引起G1期停滞 P27表达下降与癌症的发生和低存活有关，是癌症进展的重要标记。l 核的全能性？答：已经分化的供体核也能被重新编程 成年细胞核可以支持足月发育 维持分化状态的另一种机制即细胞核与细胞质之间连续的相互作用强化了一种亚稳定状态l 胚胎干细胞自我更新的分子机制？答：外部信号：LIFLIFR和gPBO（LIF受体）Jak-STAT通路，可以支持胚胎肝细胞自我更新不依赖于LIF的信号：ESRF（胚胎干细胞更新因子）内部决定因子：转录因子Oct-3与共同作用因子EIA，Sox-2相互作用，靶基因成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）、Opn和转录辅助激活因子Utfl的基因都收到Oct-3的正性调节，而GCNF作为Oct-3表达的负反馈机制存在l 细胞凋亡的发生机制？答：caspase家族，凋亡信号下游caspase包括：caspase-3、-6、-7，凋亡信号上游caspase包括：caspase-2、-8、-9、-10均为蛋白水解酶底物是蛋白质或具有蛋白质性质的物质切开部位是天冬氨酸后面的肽键活性中心最主要的是半胱氨酸残体Bcl-2家族，包括：凋亡诱导蛋白：Bax、Bak、Blk、Bad、Bid等，凋亡抑制蛋白：Bcl-2】Bcl-Xl等T