感受态细胞的制备及重组质粒的转化.ppt

感受态细胞的制备及重组质粒的转化 experimentsofmolecularbiology 重组DNA技术 重组DNA技术的基本工具 分子运输车 受体细胞经过一些特殊方法 如 CaCl2等化学试剂法 的处理后 细胞膜的通透性发生变化 成为能允许含有外源DNA的载体分子通过的细胞 即感受态细胞 competentcell 感受态细胞 competentcell 是将异源DNA分子引入一细胞株系 使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段 转化是微生物遗传 分子遗传 基因工程等研究的基本实验技术 转化 transformation 化学的方法 CaCl2法 热休克法 使用化学试剂 如CaCl2 制备的感受态细胞 通过热休克处理将载体DNA分子导入受体细胞 电转化法 使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞 通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞 转化的方法 转化原理 CaCl2法 将处于对数生长期的细菌置入0 的CaCl2低渗溶液中 使细胞膨胀 同时Ca2 使细胞膜磷脂层形成液晶结构 使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域 此时加入DNA Ca2 又与DNA结合形成抗DNase的羟基 磷酸钙复合物 并粘附在细菌细胞膜的外表面上 经短暂的42 热脉冲处理后 细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动 随之出现许多间隙 致使通透性增加 DNA分子便趁机进入细胞内 转化过程所用的受体细胞一般是限制 修饰系统缺陷的变异株 即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法 简便易行 且其转化效率完全可以满足一般实验的要求 制备出的感受态细胞暂时不用时 可加入占总体积15 30 的无菌甘油于 70 保存 半年 影响转化效率的因素 实验原理 本实验以E coliJM109菌株为受体细胞 并用CaCl2处理使其处于感受态 然后与pMD19 T X重组质粒共保温 实现转化 由于重组质粒带有氨苄青霉素抗性基因 Ampr 可通过Amp抗性来筛选转化子 如受体细胞没有转入pMD19 T X重组质粒 则在含Amp的培养基上不能生长 能在含Amp培养基上生长的受体细胞 转化子 已导入了重组质粒 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基 实验仪器 材料 1 超净工作台2 高速离心机3 恒温摇床4 恒温培养箱5 恒温水浴锅6 制冰机7 移液枪 实验材料 试剂 1 大肠杆菌JM109菌株2 重组质粒3 1 5mL离心管 Tip头4 试管 培养皿 1 LB液体培养基2 含有Amp的LB平板培养基 终浓度为50 g mL 3 氨苄青霉素贮存液 浓度50mg mL 4 0 1mol LCaCl2溶液 实验安排 1 受体菌的培养 感受态细胞的制备 2 3 质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化 实验安排 一 受体菌的培养 从新活化的E coliJM109平板上挑取一单菌落 接种于3mlLB液体培养中 37 振荡培养12h左右 直至对数生长期 已做 将该菌悬液以1 50转接于50mlLB液体培养基中 37 250rpm振荡扩大培养约1 2h 当OD600nm值为0 3 0 5时 取出置冰浴 1 取1mL菌液于1只1 5mL离心管中 置冰浴5min 10000rpm离心1min 每班需做对照管至少1管 从这一步开始 所有操作均在冰上进行 速度尽量快而稳 2 弃上清 将离心管倒置于干净吸水纸上 每管加入0 5mL冰预冷的0 1mol LCaCl2悬浮细菌 置冰浴10min 3 4000rpm离心10min 弃上清 4 每管加入50 L冰预冷的0 1mol LCaCl2悬浮细菌 冰上放置 即为感受态细胞 二 感受态细胞的制备 1 实验管加5 L重组质粒DNA 对照管加5 L灭菌水 轻轻混匀 置冰浴20min 2 42 水浴热应激90s 精确计时 迅速放回冰浴 冷却5min后加入1mLLB液体培养基 不含Amp 37 250rpm振荡培养约1h 3 取50 L菌液均匀涂布在LB琼脂平板上 含50 g mLAmp 事先做好 37 培养过夜 12 16h 后观察结果 三 质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化 切记 玻璃棒经酒精灯烧过后稍微凉一下再用 不要过烫 对照组 以同体积的灭菌双蒸水代替重组质粒 其它操作与上面相同 此组正常情况下在含抗生素 Amp 的LB琼脂平板上应没有菌落出现 本次实验组预期结果 感受态细胞长时间处在常温状态 会严重影响到其转化率 因此应尽量减少常温操作 动作要迅速 所有操作均应在冰上进行 为减少对细胞的机械损伤 操作时动作一定要轻柔 菌液涂布操作时应避免反复来回涂布