神经通路追踪技术

神经通路追踪技术 什么是神经通路 神经通路是从感受器到大脑皮质或从大脑皮质至效应器的神经元链 作为神经冲动传导的通路 称神经通路 神经传感觉传导通路 上行传导通路 从感受导通路器到大脑皮质的神经元链 运动传导道 下行传导通路 从大脑皮皮质到效应器的神经元链 那么 传导速度这样快 科学家们是通过什么技术来研究的呢 研究一般思路 给与神经元以某种物质 追踪它的输送及其输送后在神经元其它部分的定位 应用一些组织化学方法来显示中枢神经通路 如荧光法 神经通路追踪技术 凡是用于研究神经系统各结构间的纤维联系方法统称为神经通路追踪技术 例如 Golgi染色法辣根过氧化物酶轴突逆行追踪法荧光色素逆行标志法放射性核素示踪法细胞毒植物凝集素追踪法 Golgi染色法 方法 将动物灌注固定后取脑并将全脑浸于Golgi染液中2周 然后浸于30 蔗糖中 经过蒸馏水洗涤 氨化 酸性坚膜定影液反应 蒸馏水再洗涤 然后切片 采用100微米厚的震动切片 经上升梯度酒精脱水 透明 裱片后观察 目的 研究神经元之间的邻近关系以及树突 轴突的配布 辣根过氧化物酶轴突逆行追踪法 Horseradishperoxidease HRP 辣根过氧化物酶轴突逆行追踪法是利用轴浆运输现象追踪神经元间联系的一种方法 轴浆运输是神经元的一项基本活动 即沿其轴突从胞体向末梢 顺向 及从末梢向胞体 逆向 的物质运输 到达胞体或末梢的HRP 最后通过呈色反应 形成有色反应产物HRP方法的主要步骤 HRP的引入存活期神经材料的固定 取材切片及组织化学反应切片的观察 HRP法的基本用法 识别突触传入冲动的来源将HRP注入轴突终末某区 它即被摄取 并经轴突逆行送到神经胞体 从而追踪突触传入冲动的来源和去处 确定传出投射注射HRP到灰质区 可使注射区的神经元胞体摄取示踪剂并经轴索顺行输送到突触终末 神经元的Golgi样染色 Methodsrelyonasubstance sincorporationintotheneuron itstransport anditssubsequentlocalizationinotherpartoftheneuron Histochemicalmethods 注意事项 给药加压注射 离子投入和轴索损伤后标记 动物存活时间逆行输送速度 50 120mm 天 胞体内活性 2 4天 顺行输送速度 100 300mm 天 固定和切片1 多聚甲醛于1 5戊二醛 一般为冰冻切片 HRP的选择游离HRP 结合HRP 氨基酸 凝集素 某些细菌毒素等可提高其灵敏度数十倍 常用的成色方法及成色剂 成色剂显示HRP 组织化学反应步骤成色方法 是将组织培育于H2O2和成色剂 联苯胺或其衍生物 溶液内 由过氧化物 过氧化物酶系统氧化成有色产物 成色剂 二盐酸联苯胺四盐酸 DAB 联苯胺二盐酸 BDHA 四甲基联苯胺 TMB 邻联茴香胺 o D 常见神经元被HRP标记程度 1977年Kuypers等利用轴浆流逆向输送 将荧光素作为示踪剂 用不同的荧光素分别注入两个不同部位 双标记神经元 可在不同波长的激发光照射下 使神经元胞体显示出两种不同颜色的荧光 常用的荧光素有 FITC 绿色 TRITC 红色 荧光素逆行标记法 荧光素逆行标记神经元的实验步骤 荧光化合物溶液的配制荧光化合物的注射 肌肉等 动物存活期灌注固定液取材 脑或脊髓 切片 冰冻切片 贴片 盖片荧光显微镜观察 荧光逆行标记法简单 灵敏 可研究神经元的侧枝投射 但切片易褪色 不易控制注射范围和避免过路纤维的摄取 放射性核素示踪法 放射性核素示踪法是一种利用神经元轴浆运输现象进行放射性示踪剂标记 用自显影方法显示神经元与终末或神经元间联系的方法 它的一个突出优点是过路神经纤维几乎无标记 而过路纤维问题正是辣根过氧化物酶轴突逆行追踪法所难以避免的 放射性核素示踪法的主要步骤 放射性示踪溶液的配置 3H 氨基酸 放射性示踪剂引入 注射法 电泳法 存活期 固定 10 甲醛溶液 切片 贴片涂布原子核乳胶或感光材料曝光 密闭的暗盒中进行