西兰花酶蛋白的联合测定法修改版.doc

西兰花酶蛋白联合测定法1 包括：(1)可溶性蛋白(soluble protein)，(2)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)，SOD(3)过氧化物酶(peroxidase)，POD(4)丙二醛(malondialdehyde)，MDA(5)过氧化氢酶(catalase)，CAT2联合测定的原因：(1) 节省人力，节省提取研磨过程(2) 节省待测样品3联合测定的可行性：（1）汪俏梅，郭得平（2004）对POD、SOD、CAT进行联合测定。取1g西兰花样品，按1:5(W/V)加入0.05mol/L，pH7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆于4，13000g离心20min，上清液为酶提取液，分别测定POD、SOD、CAT活性。（2）叶陈亮，柯玉琴，陈伟（1996），对可溶性蛋白、MDA、SOD、LOX进行联合测定。称1g花蕾，用含1%聚乙烯吡咯烷酮的50mmol/L，pH7.0磷酸缓冲液4ml与冰浴中研磨匀浆，15000r/m冷冻离心10min，上清液备用。 取上清液50l，按Folin-酚法测定可溶性蛋白质含量； 取上清液1.25ml，加水1.25ml和0.5%硫代巴比妥酸三氯醋酸溶液2.5ml混匀，煮沸10min后离心比色测定，按陈贵推荐公式计算MDA含量； 取上清液10l，按朱广廉法测定SOD活性，以SOD抑制NBT光化学还原50%所需酶量为一个酶活性单位； 取上清液0.5ml，按Surrey法比色测定LOX活性，以每分钟增加1个OD值为一个酶活单位。4联合测定的缺点（1）时间比较紧张，要求合理安排顺序，相互之间溶液干扰；（2）最好是同时做，人员比较多；（3）仪器，尤其是分光光度计要求要足够，不要相互之间抢；（4）需要标准曲线的最好一起做，它要求所有待测样尽量在同一条件下测定。其它酶也是么？解决，减少实验次数，集中在1-2次内完成。做大量的预备实验，熟练技能。达到实验组每个成员倒背如流。5 方案想最后都一起测，理由是我们认为可以保证较低温度和酶活性不失活，并且我们保证人员充足，速度达到或接近单个指标的测定。如果大批量同时测的话，分光光度计最多可以得到3台/4台。复合物的提取（主要是酶）（一）冰浴研磨法1 取样，1.0g西兰花花蕾样品2 放入事先预冷的研钵，先加入2ml的提取液（先预冷），加入少量石英砂，冰浴研磨至匀浆3 再加入3ml提取液继续研磨4 转移至10ml离心管，用2ml提取液冲洗研钵，混匀5 冰浴抽提30min，不时的轻摇6 离心，4，13000g，15min7 将上清转移至带刻度的试管，记录每一试管的体积8 将酶液保存在冰浴中，严格保护，备用注（1）提取液总体积为7ml，即选用7倍体积的提取液（2）提取缓冲液成分：50mM磷酸缓冲液pH7.5内含（1）PVP 1%（2）EDTA 2mM，pH8.0（3）-巯基乙醇 0.04%（二）液氮研磨法1 取样，1.0g西兰花花蕾样品2 放入事先预冷的研钵，加入液氮，并加入少量石英砂，研磨至粉末，用预冷的药匙将粉末转移至10ml离心管，加入7ml提取液，冰浴保护30min，不时摇匀3 离心，3900rpm，20min，尽量保持在低温4 将上清液转移至10ml量筒，记录体积，转移至10ml离心管，低温保护备用第一部分 可溶性蛋白含量的测定考马斯亮蓝（G-250）法一、 原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大吸收在488nm，当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其吸光值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间达到平衡，完成反应非常迅速；其结合物在室温下1小时内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便、快捷，反应非常灵敏。灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级的蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01000g/ml，是一种非常常用的微量蛋白快速测定方法。二、 试剂配制1牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中，即为1000g/ml的原液（4保存）。2 蛋白染色剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mgG-250，溶于50ml90%乙醇中，加入100ml85%（w/v）的磷酸，最后定容至1000ml。此溶液在常温下可保存1个月。注意：（1）乙醇可用无水乙醇配，无水乙醇与95%乙醇价格差0.5元左右；（2）磷酸本身浓度为85%。三、 标准曲线的制作1标准曲线的制作（1）0100g/ml标准曲线的制作取6支10ml干净的具塞带刻度的试管，按表一取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后，用1cm光径的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD值，并做出标准曲线。表一 0100标准曲线管号1234561000g/ml母液(ml)00.020.040.060.080.10DH2O(ml)1.000.980.960.940.920.90G-250试剂(ml)555555蛋白质含量(g)020406080100OD250（2）01000g/ml标准曲线的制作取6支10ml具塞试管，按表二取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为01000g/ml的标准曲线。表二 01000g/ml标准曲线管号1234561000g/ml母液(ml)00.20.40.60.81.0DH2O(ml)1.000.80.60.40.20.0G-250试剂(ml)555555蛋白质含量(g)02004006008001000OD250（3）0150g/ml标准曲线的制作取6支10ml具塞试管，按表三取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为0150g/ml的标准曲线。表三 0150g/ml标准曲线管号1234561000g/ml母液(ml)00.030.060.090.120.15DH2O(ml)1.000.970.940.910.880.85G-250试剂(ml)555555蛋白质含量(g)0306090120150OD2503 样品提取液中蛋白质浓度的测定取2支试管（10ml具塞，作为2个重复），按下表加样：表3管号1314待测样品(ml)0.080.08DH2O(ml)0.920.92G-25055OD595蛋白质含量四、 计算结果样品中蛋白质含量（g/gFW）=其中X为在标准曲线上查得的蛋白质含量，g；V0为提取的总体积，ml；V1为测定蛋白质时所用的体积，ml；W为样品鲜重，g。第二部分 超氧化物歧化酶的测定参考李合生、孙群、赵世杰、章文华编的植物生理生化实验原理和技术167页一、 原理超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，简称SOD）是需氧生物中普遍存在的一种含金属酶，它能够防御活性氧或其它过氧化自由基对细胞膜系统的伤害，因此，其活性与植物抗性密切相关。2O2-2HH2O2H2O22H2OO2依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在的条件下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条下极易再氧化而产生O2，O2可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm出有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。根据此可算出酶活性的大小。二、试剂1130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称取1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。2750mol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。3100mol/LEDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。420mol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素蒸馏水定容至1000ml，避光保存。三、实验步骤1 SOD的提取，使用联合测定法提取的酶液。2 显色反应取5ml指形管（或试管，要求透明度好）4支，2支为测定管，2支为对照管，按下表1加入各溶液：表1 溶液显色反应用量试剂（酶）用量（ml）终浓度0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750mol/LNBT溶液0.375mol/L100mol/LEDTA-Na20.310mol/L20mol/L核黄素0.32.0mol/L酶液0.102支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.20总体积3.0混匀后将1支对照管放置暗处，其它各管于4000lx日光下反应15min（要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。3 SOD活性测定与计算至反应结束后，并将各管遮光放置，以不照光的对照管为空白，分别测定其它各管的吸光度。二、 结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性=SOD比活性=式中：SOD总活性以鲜重酶单位每克表示；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；ACK为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液的体积，ml；Vt为测定时样品用量，ml；W为鲜重，g；蛋白质含量单位为mg/g。第三部分 过氧化物酶的测定张志良植物生理学实验指导，1990一、 实验目的过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切的关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反应某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握其测定方法愈创木酚法。二、原理在过氧化物酶（peroxidase）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下的吸光度变化测定过氧化物酶活性。三、试剂1 20mM KH2PO4(提取液)（我们用0.05M磷酸缓冲液）2 100mM磷酸缓冲液（原文pH6.0）3 30%H2O2（原试剂）4 愈创木酚（原试剂）四、实验步骤1 POD的提取，使用联合测定法提取的酶液。2 POD测定混合液的配制100mM磷酸缓冲液 50ml愈创木酚 28l（1）将上述溶液混合，磁力搅拌器搅拌，加热溶解后，冷却至室温（2）加入19l 30%H2O2（3）保存在冰箱中备用3 酶活性测定（1）测定体系反应体系溶液对照待测样1待测样2混合液3.0ml3.0ml3.0ml提取缓冲液1.0ml0.7ml0.7ml酶 液0.0ml0.3ml0.3ml（2）加入溶液后，秒表立即计时，分别记录20s，60s波长下的吸光值。(时间想改为20s+40s?)五、结果计算以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（u）。过氧化物酶活性=式中：A470为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重，g；t为反应时间，min；VT为提取酶液总体积，ml；Vs为测定时取用酶液体积，ml。第四部分 丙二醛的测定参考上海植物生理研究所编的现代植物生理学实验指南305页一、 原理丙二醛（malondialdehyde，MDA）是常用的脂质过氧化指标，在酸性和高温条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,3,5-三甲基恶唑2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最重要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA-TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532nm、450nm处的消光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需要有一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100300g/gDW,根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3的终浓度为0.5nmol/L。三、 试剂110%的三氯乙酸（为什么用它，水可以么）20.6%的硫代巴比妥酸（用10%三氯乙酸溶解不太好溶）（配法：称取0.6g硫代巴比妥酸，加入10ml 1mol/L的NaOH溶液，加热溶解，再加入11ml1.0mol/L的HCl溶液，然后转移到100ml容量瓶中，5小时内使用）四、 实验步骤1MDA的提取，使用联合测定法提取的酶液。2MDA测定体系对照待测1待测2TBA溶液（ml）2.02.02.0磷酸缓冲液0.05M(ml)2.01.01.0酶液0.01.01.0按上表加入各溶液，混匀后于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450nm波长下的消光度。3含量计算，采用双组分光广度计法，根据公式(1)：C1(mol/L)=6.45(D532D600)0.56D450 （1）其中C1为MDA的浓度，D450、D532、D600分别代表450nm、532nm、600nm波长下的消光度值。此外还可以计算出溶液中可溶性糖的浓度C2。C2（mmol/L）=11.71D450 （2）第五部分 过氧化氢酶的测定反应条件：将底物溶液37预热。H2O2混合液（底物）： 取0.1ml 30%市售H2O2，用50mM的磷酸缓冲液（pH7.0）进行稀释，定容到50ml。（市售H2O2约为17.6mol/L，稀释后浓度约为35.2mM）。对照：0.1ml酶液+2.9ml 蒸馏水待测：0.1ml酶液+2.9ml H2O2混合液测定：加入样品后20s稳定时间，40秒测定时间，记录20s和60s的240nm下的吸光值，计算40s内吸光值的变化。每次测定一个样品。重复2次。注意：紫外波长要用石英比色杯。第六部分 过氧化氢酶的测定参考：（1）郝再彬、苍晶、徐仲编的植物生理实验技术202页（2）杨瑞红、原老师的方法。B 施特尔马赫，钱嘉渊译.酶的测定方法.中国轻工业出版社，1992，186-188.过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗旱、抗病能力有一定关系，故常加以测定。一、 原理H2O2在240nm波长下有强吸收，过