纯化水细菌、霉菌及酵母菌计数验证方案(交).doc

纯化水细菌、霉菌及酵母菌计数验证方案1 概述：本本法是用于建立微生物检查法时，根据中国药典2005年版二部分要求，需对细菌、霉菌及酵母菌的计数方法进行验证。故计划于2006年9月份对细菌、霉菌及酵母菌的计数方法进行验证。2 原理：根据不同的样品，制备成供试液，再将规定量的供试液通过膜微过滤系统真空抽滤，将滤膜进行培养，对形成的菌落计数，或通过采用平皿法对形成的菌落计数，从而了解供试品的微生物含量。3 菌种：大肠埃希菌CMCC（B）44102金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003枯草芽孢杆菌 CMCC（B）65301白色念珠菌CMCC（B）98001黑曲霉CMCC（B）980034 培养基：营养琼脂培养基 改良马丁琼脂培养基 5 试剂：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 0.9%无菌氯化钠溶液 6 设备：MILLPORE 微膜过滤系统7 检测方法：7.1菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养琼脂培养基中培养37培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液将培养物制备成菌悬液，用细菌比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，经梯度10倍稀释至10-5-10-7，约为50-100CFU/ml，供活菌计数及验证试验用。接种白色念珠菌新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中25-28培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液将培养物制备成菌悬液，用细菌比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，经梯度10倍稀释至10-5-10-6，约为50-100CFU/ml，供活菌计数及验证试验用。接种黑曲霉孢子液至改良马丁琼脂培养基中，经25培养5-7天，加入3-5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸取孢子悬液，用细菌比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，经梯度10倍稀释至10-4，约为50-100CFU/ml，供活菌计数及验证试验用。 7.2活菌计数 分别取上述大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌10-5-10-7稀释液各1ml加入平皿，再用不超过45的营养琼脂培养基20ml注皿，每个菌株各测定2皿，30-35培养48小时，计算菌落数。分别取上述白色念珠菌10-5-10-6稀释液、黑曲霉10-4稀释液各1ml加入平皿，再用不超过45的琥珀红琼脂培养基20ml注皿，每个菌株各测定2皿，23-25培养逐日观察计数。7.3供试液的制备取供试品10ml加入到pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml中，混匀后即为1：10供试液。取上述1：10供试液，加入到pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml中，混匀，作为1：100供试液。7.4回收率的测定薄膜过滤法：7.4.1.试验组：取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜，后取1：100供试液100ml、50-100cfu试验菌同时加入滤杯中，抽滤，后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中，共制备两张滤膜，置规定温度培养规定时间，逐日观察结果。7.4.2.菌液组：取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜，后取灭菌pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml、50-100cfu试验菌同时加入滤杯中，抽滤，后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中，共制备两张滤膜，置规定温度培养规定时间，逐日观察结果。7.4.3.供试品对照组：取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜，后取1：100供试液100ml加入滤杯中，抽滤，后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中，共制备两张滤膜，置规定温度培养规定时间，逐日观察结果。8 验证内容、方法及限度：8.1 设备确认8.1.1 检查验证所使用的设备的检定状，并按下列方式记录检查结果。设备名称及型号产地检定结论备注MILLPORE 微膜过滤系统美国8.1.2 检查纯化水的细菌、霉菌及酵母菌计数测定的方法验证所需文件。文件名称存放处微生物限度（细菌、霉菌、酵母菌含量）测定标准操作细则三联式Microfil过滤系统使用标准操作细则中华人民共和国药典2005年版二部8.2回收率的计算按如下公式计算试验组的加菌回收率： 试验组的平均菌落数供试品对照组的平均菌落数试验组的加菌回收率 100% 菌液组的平均菌落数8.2试验限度