HLA-B27检测.ppt

PCR SSP检测HLA B27 一 实验目的掌握HLA基因分型的原理 学习PCR SSP基因分型方法 二 实验原理编码HLA的基因具有高度的多态性 每一个基因座位上有众多的复等位基因 而每一个等位基因都有其各自的DNA序列 因此可用相应的序列特异性引物 sequencespecificprimers SSP 进行扩增 通过控制PCR反应条件 特异性引物仅扩增与其相应的等位基因 而不扩增其他的等位基因 实验步骤 PCR扩增 琼脂糖凝胶电泳 抽提DNA PCR扩增的基本原理 模板DNA的变性 热变性 模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 模板DNA与引物的退火 复性 模板DNA经加热变性成单链后 温度降至55 左右 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 引物的延伸 DNA模板 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下 以dNTP为反应原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性 退火 延伸三过程 2 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 PCR扩增体系 模版DNA上游引物下游引物dNTP 原料 缓冲体系 各种离子与水 耐热的DNA聚合酶 PolymorphismintheMHCVariation 1 atasinglegeneticlocusinapopulationofindividualsEachpolymorphicvariantiscalledanalleleInthehumanpopulation over1 200MHCalleleshavebeenidentified MHCgenesarethemostpolymorphicknown Polymorphicresiduesarelocatedintheantigen bindinggroove Variationinaminoacidsequenceschangestheshapeofthegroove SchematicdiagramofclassIandclassIIMHCgenes mRNAtranscripts andproteinmolecules EveryHLAallelehasitsownuniquesequences Specificsequenceprimer SSP isdesignedtobindtotheallelicsequencescomplementarily SequencespecificprimerisusedtotypeHLAallelewithPCR SequencespecificprimerisusedtotypeHLAallelewithPCR 三 实验材料和方法1 血样 0 2mlEDTA抗凝血2 红细胞裂解液3 白细胞裂解液4 PCR混合液PCRbufferHLA B27SSPTaqdNTPinternalpositivereferenceprimers HLA B27检测操作流程 一 DNA的提取1 取1mlRBC裂解液入血样管中混匀 裂解RBC 2 离心4000rpm 2min 3 重复步骤1 2两次 最后用棉签吸干管壁液体 4 取100ulWBC裂解液入上述WBC管中混匀 5 将WBC管于60oC水浴消化20min 6 取出WBC管再于100oC 3 5min 灭活蛋白酶K 7 离心10000rpm 2min 上清即为富含DNA的PCR模板 二 PCR扩增1 吸2ul模板DNA入装有PCR混合液的小管中 注意不要加到石蜡油层 2 将小管置于PCR仪内进行扩增 需80min 12 23 预变性 94oC2min变性 94oC12sec复性 62 1min延伸 72 30sec变性 94oC12sec复性 58oC50sec延伸 72oC30sec37oC10sec HLA B27扩增程序 三 电泳检测吸PCR产物10ul加到2 琼脂糖凝胶孔内 将琼脂糖凝胶板置电泳槽内电泳160V 20min后取出 观察结果 四 结果