仪器分析课程论文

毛细管电泳综述摘要：自 1988 年第一台商品化的毛细管电泳仪问世，距今已有二十多年的时光。在这期间， 毛细管电泳（CE）技术无论在理论还是应用方面，都得到了飞速的发展。今天，CE 技术 已逐渐成熟，在分析化学、生物化学、环境化学、材料化学、临床化学、有机化学、天然 产物化学和药物化学等领域有着广泛的应用。CE 技术作为一种强有力的分离分析手段， 已成功地应用于小分子、大分子、中性化合物和荷电化合物的分离。检测器是毛细管电泳仪器的关键部件，本文主要对毛细管电泳的检测器进行讨论，介绍一下我们自制的电导检测器。关键词：毛细管电泳，检测器第一章 前言电泳是指带电粒子在电场作用下向电性相反的方向迁移的现象，据此对某些化学或生物化学组分进行分离的技术称为电泳技术。毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)，是指以毛细管为分离室，以高压电场为驱动力的一类新型现代电泳技术，它于 80 年代中后期迅速发展，其原理是在高压电场和毛细管分离通道中，依据试样中各组分电泳淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类分析技术。与经典电泳相比，毛细管电泳法克服了由于焦耳热引起的谱带宽和柱效较低的缺点。毛细管电泳引入高的电场强度，改善了分离质量，具有分离效率高、速度快和灵敏度高等特点，而且所需样品少、成本低，更为重要的是，它又是一种自动化的仪器分析方法。毛细管电泳法与高效液相色谱一样同是液相分离技术，在很大程度上两者互为补充，但无论从效率、速度、用量和成本来说，毛细管电泳法都显示了它独特的优势。毛细管电泳分离技术与传统的平板电泳和现代液相色谱分离技术相比具有很多优点：1.高效（105-107理论塔板数/米）；2.快速（几十秒至几十分钟）；3.分离模式多，选择自由度大；4.分析对象广，从无机离子到整个细胞；5.高速自动化；6.样品需量小，无环境污染,运行成本低，如:毛细管电泳可通过改变操作模式和缓冲液成分，根据不同的分子性质(如大小、电荷数、疏水性等)对极广泛的物质进行有效分离,而高效液相色谱法要用价格昂贵的色谱柱和溶剂。可见，毛细管电泳法具有仪器简单、分离模式多样化、应用范围广、分析速度快、分离效率高、灵敏度高、分析成本低、环境污染小等优点。CE的研究可追溯到 60 年代，1967 年由 Stellen Hjerten 撰写的一篇论文，他使用 3 mm 内径的石英毛细管，进行自由溶液区带电泳(CZE)1，由于意识到焦耳热会引起严重的峰展宽，他使用旋转毛细管的方法减小温度梯度的影响。1974 年，Virtanen 通过实验比较，认为使用细内径毛细管是降低焦耳热效应、提高分离效率的主要方法2。1979 年，Mikkers 采用 200 m 内径的聚四氟乙烯管和电导检测器分离了 16 种有机离子，获得了 105 plates/m 的高柱效3，这是毛细管电泳发展中第一个突破性成就。第二个突破性成就是 Jorgenson 等人于 1981 年完成的4，他们采用内径为 75 m 的石英毛细管和荧光检测器，配以 30 kV 的高电压，获得了 4 105 plates/m 的柱效，使传统电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)相媲美的新颖的分离和分析技术高效毛细管电泳(HPCE)。1983 年 Hjerten 开展了很多开创性的工作，把传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳移植到毛细管中，创建了毛细管凝聚电泳(CGE)5；1984 年 Terabe 在毛细管中使用含有表面活性剂 SDS 的背景电解质溶液成功地分离了中性分子和小分子，开创了胶束电动毛细管色谱(MEKC)6；1985 年 Hjerten 结合传统的等电聚焦技术，提出了新的毛细管等电聚焦技术(CIEF)7；1987 年 Knox 等利用超细的液相色谱填料填充毛细管，发展了毛细管电色谱技术(CEC)8。至此，在短短的几年内形成了毛细管电泳的几种主要分离模式。 此后，毛细管电泳与其它分离手段的联用技术亦开始发展起来，如毛细管电泳-质谱联用技术(CE-MS)9、液相色谱-毛细管电泳联用技术(LC-CE)10、等速电泳-毛细管区带电泳联用技术(ITP-CE)11等。目前，毛细管电泳成为上一世纪后二十年分析化学领域中发展最迅速的分离分析方法，其研究已成为分析化学领域的热门方向，应用范围迅速扩大1216。第二章 毛细管电泳分离技术的几种模式1. 毛细管区带电泳（CZE）毛细管区带电泳(CZE，capillary zone electrophoresis)是毛细管电泳中最基本也是应用最广的一种操作模式，也称毛细管自由溶液区带电泳，我们通常把它看做其他各种操作模式的母体。CZE是基于样品中各个组分间荷质比的差异，在外加高压电场作用下依据样品中各离子成分电泳淌度的不同而实现分离的。电泳过程中所采用的背景电解质是缓冲溶液，在缓冲溶液中加入一定量的添加剂，可以提高电泳的分离选择性，抑制毛细管壁的吸附，或者改变电渗流的大小和方向。其中带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和正离子与两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；而中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子则两种效应的运动方向相反；当电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。2. 毛细管凝胶电泳（Capillary Gel Electrophoresis， CGE）琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是普通电泳中的两种形式，特别是对于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），由于SDS是一种阴离子表面活性剂，可以与蛋白质作用将其改性，把球形蛋白质变为棒状，SDS将蛋白质的原有电荷掩盖，使各种蛋白质表现为相同的电荷密度，蛋白质的迁移速度与它们的有效直径有确定的关系，用来测定蛋白质的分子量。将SDSPAGE移入毛细管内进行就形成了CGE，在CGE中样品的用量可以明显减少，可以实现定量分析。其原理就是将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高；缺点是制备柱较困难，寿命较短。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。3. 胶束电动毛细管色谱（MEKC）胶束电动毛细管电泳(MEKC，micellar electrokinetic chromatography)是Terabe在1984年首先提出的60，问世以后，立即引起了学术界的广泛重视。这一技术的最大优点是使毛细管电泳有可能在进行离子型化合物分离的同时分离中性物质，因此在各个领域特别是生物、医药方面显示了广泛的应用前景。在MEKC缓冲液中加入离子型表面活性剂，使其浓度达到临界浓度，表面活性剂单体就会结合在一起，形成一个球体，即为胶束。胶束通常外部亲水，内部疏水，在电场力的作用下，胶束在柱中移动。电泳和电渗流的方向相反，且电渗流 电泳 ，负电胶束以较慢的速度向负极移动；中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，在毛细管柱内向负极迁移的速度慢，流出时间长，这样可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；SDS是最常用的一种表面活性剂，SDS胶束相叫准固定相。MEKC比高效液相色谱更为高效，HPLC 分离柱效为500025000理论板数/m，MEKC 可达到50000500000理论板数/m 。比高效液相色谱更为高速，MEKC分离时间通常小于30min，但达到相仿效率的毛细管LC，需要更长的时间。4. 毛细管等电聚焦（CIEP）毛细管等电聚焦（Capillary Isoelectric Focusing, CIEF）是一种根据等电点差别来分离生物大分子的高分辨率电泳技术，使用两性电解质的混合物（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物）做载体，当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；具体为当压力进样将样品（通常为蛋白质）加入毛细管后，施加电压大约35min，带正电的流向阴极，带负电的流向阳极，使阴极端的pH值升高，阳极端的pH值降低，在毛细管内即形成了pH梯度，氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；蛋白质样品在毛细管内停留在各自的等电点（pI）处，这一过程毛细管迁移电流逐渐降低到零。最后是将NaCl 加入到盛有NaOH的阴极槽内，再加68kV的高压，使Cl离子进入毛细管，在近阴极端的pH降低，使已经聚焦的蛋白质依次通过检测器，这一过程毛细管迁移电流逐渐升高。5 毛细管等速电泳（Capillary Isotachophoresis ，CITP）(1) 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。(2) 负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。(3) 不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=E)，淌度大的离子区带电场强度小；(4) 沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4 电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“2”号中离子跑到“1”号区，离子被减速使之归队。毛细管等速电泳的特点：界面明显，富集、浓缩作用；6 毛细管电色谱（CEC）毛细管电色谱(Capillary electrochromatgraphy, CEC)是在CE技术不断发展和色谱理论日益完善的基础上逐步兴起的结合体，是电泳迁移原理和色谱分离原理相结合的新型微分离分析技术。CEC是在1974年首先提出的，Pretorious95指出在毛细管中可以使用电流作为驱动力，但由于使用的毛细管内径太大，未能显示出电色谱的优势。因此直到20世纪80年代毛细管电色谱才开始受到人们的广泛重视。1981年，Jorgenson等96使用ODS毛细管填充柱，尝试以电渗流来推动流动相，同时高效分离了几种中性化合物，成为毛细管电色谱发展中的里程碑。根据所用毛细管柱的不同，CEC可以分为以下三种经典方法：填充毛细管电色谱(p-CEC)、开管毛细管电色谱(OT-CEC)和整体毛细管电色谱。1982年Tsuda等97首次进行了开管毛细管电色谱(OT-CEC)实验，证明了开管毛细管电色谱(OT-CEC)具有很高的分离能力。毛细管电色谱对中性化合物的分离机制主要基于分析物与固定相间的相互作用，对带电化合物的分离取决于分析物的电泳淌度和其与固定相间的亲和性。是在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程。另外还可以按操作方式重新分为手动、半制动及全自动型毛细管电泳，或按分离通道形状分为圆形扁形方形毛细管电泳等等。我们还可以通过对分配系数Kp、电渗率Uos、电泳淌度u等的取舍，重新归类毛细管电泳。但是无论采用何种分类方法，毛细管电泳总是包含了一族或是一类的方法，不是一种或者单一的方法。毛细管电泳的多种分离模式，给样品分离提供了不同的选择机会，这对复杂样品的分离分析，是非常重要的。第二章 检测器检测器是毛细管电泳仪的关键部件，灵敏度是检测器的重要指标，常用的商品检测器有紫外和荧光两种，此外也有电化学和质谱检测器。最常用的是紫外检测器，灵敏度顺序为固定波长可变波长光电管二极管。1. 紫外检测器这是高效液相（HPLC）和高效毛细管电泳（HPCE）中使用最多的一种，其原理就是朗伯-比尔定律。目前有三种主要类型，即固定波长、可变波长、二极管阵列检测器。需要指出的是紫外检测器因其光路长度受毛细管内径的限制，使得其检测灵敏度相对较低，通常在几个ppm的水平上，它的线性范围通常在34个数量级。它的检测光窗就在毛细管柱上。2. 荧光检测器荧光检测器是高效毛细管电泳灵敏度较高的一种检测器，它的检测下限可到10-15 mol的水平，激光诱导荧光检测器的灵敏度则跟高。它的原理与高效液相中荧光检测器相同，激发光可以使紫外光也可以是激光。与紫外光谱一样，荧光检测也是在柱上进行，它是将一个弧光灯或一束激光发生的辐射聚焦在毛细管壁上，通过一个棱镜系统或则光导纤维将产生的荧光收集到一个与激光光束成900的位置。通常用的激光光源的波长是325nm，强度为5-10 mV的He-Cd 光源。3 电化学检测器电化学检测器是微柱分离体系的理想检测方法。这主要由于反应是在电极表面上进行的，检测池的小型化有利于待测物质向电极表面的传递，当电极表面积减小时，可提高信噪比，因此，毛细管电泳的电化学检测器允许使用微电极。电化学检测法主要有安培发、电导法和电势法，其中安培法最灵敏。利用碳电极和金属电极进行毛细管电泳（HPCE）安培检测，检测限可达10-810-9mol/L。由于其只对电活性物质有响应，选择性较好。安培检测器不需要光学元器件，制造简单，造价低。因此其作为电化学检测的代表正在成为生化分析技术中很有前景的新技术。4 质谱检测器质谱可以提供检测物质分子量和结构信息的重要检测技术，质谱仪有很多种类，如CZE，MEKC，CITP，CGE和ACE以及CEC等都能与质谱检测器成功地连接，其中应用较多的仍是CZE-MS。MEKC由于添加表面活性剂形成的胶束会抑制样品离子的信号，所以MEKC-MS使用较少。与CE相连的MS最常用的电离方式是ESI，可以直接把样品分子从液相转移到气相，而且可以测定分子量较大的样品。与CE相连的质谱仪主要有三元四极（QQQ）质谱仪，离子阱（TTT）质谱仪，傅立叶转换离子回旋加速器共振（FT-ICQ）质谱仪和飞行时间（TOF）质谱仪等，前两者较为常用。CE-MS常用的接口有无套管接口，液体接合接口和同轴套管流体接口等三种，后两种接口均在毛细管流出部分引入补充流体，以维持一个稳定的电喷雾流。CE-MS所使用的缓冲液最好是易挥发、低浓度，可获得较好的离子流响应。与质谱相连的CE中常使用加入较高含量的有机溶剂（例如甲醇、乙睛）的缓冲液或者使用非水毛细管电泳，有利于离子喷雾过程，可以增进检测的灵敏度。天然植物药各组分之间以及药物与其代谢产物之间往往结构比较相似，用CE-MS无论对分离及鉴定都显示了优势。Henion等用同轴套管流体接口，全扫描质谱方式分离了8种合成的异哇琳生物碱，对威氏黄柏（Phenllodendron wilsonii）树皮中的8种组分进行了分离并鉴定了其中的6种。Unge等用同样接口将卢竹碱等巧种叫垛类生物碱和生物胺基线分离。此外，离子喷雾（Ionspray，ISP），大气压化学电离（APCI）等也被应用在CEMS中。第三章毛细管电泳分离条件的选择毛细管电泳的基本操作包括毛细管的安装、洗涤、电泳介质的灌入、进样和分离等。进样和分离是比较重要的部分。进样方法有电迁移、压力进样、场放大进样等。分离一般采用恒压模式，也可采用恒电流和恒功率模式。分离条件一般包括缓冲液、电渗控制、电场强度、温度、分离模式等。1. 分离电压一般，在毛细管柱的长度确定时，随着分离电压的增加，电渗流和电泳速度的绝对值都将增加。迁移时间缩短。同时升高电压，毛细管电泳电流增加，产生的焦耳热增加，使溶液内部产生温度梯度，从而影响柱效。因此适宜的电压是毛细管电泳所必须的。2. 电泳缓冲液电泳分离过程是在缓冲液中进行的，缓冲液直接影响离子的迁移和最后的分离，甚至影响进样过程。选择缓冲液要遵循如下原则：（1）在所选择的pH范围内有很好的缓冲容量（2）较低的背景吸收（3）自身的淌度低，即分子体积大，电荷小，这样产生的焦耳热小，有利于提高柱效（4）只要条件允许，尽量采用酸性溶液，有利于获得较小的电渗流淌度和较大的分离度。缓冲液的浓度是一个很重要的指标，增加浓度，可以使离子强度增加，可以明显增加缓冲液的容量，减小溶质组分与毛细管内壁的相互 作用，改变迁移时间，改善分离。但是当浓度增加时，毛细管电泳电流增加，焦耳热增加，影响分离度。3. 添加剂添加剂是CE中一个十分重要的控制因素，表面活性剂是使用最多的一种。表面活性剂均可用于毛细管区带电泳和毛细管胶速电动色谱中，前者的表面活性剂的浓度低于其临界胶速浓度，后者则相反。后者主要用作准固定相。常用的有SDS、十六烷基三甲基季氨溴、三羟基甲基氨基甲烷（Tris）、2-（吗啉）乙烷磺酸（MES）、甲基纤维素、PEG等。有机溶剂也可被广泛用作添加剂，不同有机溶剂的作用各不相同。有机溶剂的加入可以明显的减少电渗流速度，使分离度增加。它还可以增加有机样品的溶解度，改变选择性。常用的有甲醇、乙醇、乙腈、三氟乙酸酐等。手性添加剂的加入可以极大地改善手性对映体的分离度，通常用作手性分离添加剂的有环糊精及其衍生物、冠醚、胆汁盐、抗生素等，50%的手性分离使用的是环糊精。进来也有用杯芳烃进行手性分离的研究成果报道。手性拆分有直接和间接拆分两种。直接拆分分为1主客体配合2配位体交换配合3手性交束包容蛋白质亲和等类型。主客体配合是指被分析物质在空间上与主体分子形成配合物的过程，通常用的主体分子有环糊精和手性冠醚，目前杯芳烃衍生物也得到了一定的应用。间接拆分实际上是一种柱前衍生后进行CE分离的方法，衍生试剂应满足以下条件1反应快产物稳定没有消旋过剩试剂不干扰测定含有很强的生色基团和荧光性质。4温度在CE中，温度的影响主要通过粘度体现出来，淌度是粘度的函数，因此温度的控制非常重要。仪器的进展1 检测器和联用技术近年来，毛细管电泳的检测器和联用技术发展很快，Zhang 和 Paze 综述了荧光检测器 的进展96-97, Liu 综述了电化学检测器的进展98, Matysik 综述了在非水毛细管电泳中，电化 学、荧光和质谱检测器的特点及其应用99, Wu 综述了毛细管电泳整体检测技术，该技术在 毛细管等点聚焦中有着较好的应用前景100。 有关 CE 的联用技术也有较快的发展，Von Brocke A101综述了 CE-MS 的进展，Miranda 综 述了流动注射与 CE 联用技术的进展102, Valcarcel 综述了用于在线样品预处理的自动恒流 系统(CFS-CE)与 CE 的联用技术103，陈义等研究了瑞利光散射检测器和 CE 的联用，并用 于测定金属离子104。2 微流控芯片（Chips）: 微流控芯片作为一个重要的技术领域，得到越来越多的关注，其所涉及的对象从生物 、生物小分子（氨基酸、神经递质） 、胶体微粒到金属离子、无 大分子（DNA、蛋白、糖） 机物等。对于微流控芯片的装置、理论研究和应用的最新进展有多篇综述105-109。展望毛细管电泳也存在一些问题1毛细管制备能力差，光路太短，非高灵敏度的检测器难以测出样品峰；凝胶、色谱填充管需要专门的灌制技术；大的侧面/截面积比能放大吸附的作用，导致蛋白质等的分离效率下降或无峰；吸附引起电渗变化，进而影响分离重现性等，目前尚难以定量控制电渗。CE技术的研究和应用，给药物分析领域和药品检验工作带来了生机与活力，无疑将对该专业技术的发展及提高起着重要的推动和促进作用。尤其以对基因工程药物、中成药复方制剂的分析和中药材种属的鉴定，令人瞩目。但任何事物都有两面性，它也有弱点和不足，如有的药物用CE分析精确度还不够高；有的灵敏度很高，但专属性界定尺度又不易掌握；CE仪器昂贵，很难普遍推广等等，都需要不断研究解决。尤其以如何巧妙地与其它方法和技术（如HPLC、MS等）联合使用，以收到更好的效果，是今后CE技术研究、完善的方向和课题。可喜的是，这方面的工作已开始启动，CE一HPLC、CE一MS联用己取得高效率、高质量的分析成果。经过科学工作者的不懈努力，一个药物分析领域的新技术快速发展时期即将到来。1Hjerten S. Free zone electrophoresis. Chromatographic Reviews. 1967, 9(2): 122-219.2Virtenen R, Acta. Polytech. Scan., 1974,123: 1.3Mikkers F E P, Everaerts F M, Verheggen T P E M. High-performance zone electrophoresis. J. Chromatogr.,1979,169: 11-20.4Jorgenson J W, Lukacs K D. Zone electrophoresis in open-tubular glass capillaries. Anal. Chem., 1981, 53(8): 1298-1302.5Hjerten S. High-performance electrophoresis:the electrophoretic counterpart of high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr., 1983, 270: 1-6.6Terabe S, Otsuka K, Ichikawa K, Tsuchiya A, Ando T. Electrokinetic separations with micellar solutions and opentubular capillaries. Anal. Chem.,1984,56(1): 111-113.7Hjerten S, Zhu M D. Adaptation of the equipment for high-performance electrophoresis to isoelectric focusing. J. Chromatogr.,1985, 346: 265-270.8Knox J H, Grant I H. Miniaturization in pressure and electroendosmotically driven liquid chromatography:some theoretical considerations. 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