L05066林雪芬

项目类别项目批准号BL05066附件3 华南农业大学大学生科技创新活动项目结题书项目名称：反向胶团修饰蚯蚓纤溶酶及其性质研究 申 请 人： 林雪芬 王铭铎 所在院部： 生 命 科 学 学 院 专业年级： 2002级 生 物 技 术 联系电话：指导教师: 徐凤彩 高向阳 职称 教授 副教授 立项日期： 二五 年 四 月 二十 日 结题日期： 二六 年 四 月 七 日华南农业大学大学生科技创新活动项目指导中心 填 表 说 明 一、 填写结题报告书前，请先咨询指导教师或有关专业教师。申请书的各项内容要求实事求是，逐条认真填写。表达明确、严谨，一律要求用打印稿件。 二 、申请书为A4复印纸，于左侧装订成册。一式三份（至少一份原件），由指导教师和所在院（部）审查并签署意见后报大学生科技创新活动项目指导中心。三 、一级标题三号宋体加粗，用“一、二、三”标示；二级标题四号楷体加粗，用“（一）（二）（三）”标示；三级标题四号仿宋加粗，用“1、2、3”标示；四级标题四号仿宋，用“”标示。示例：一、XXXX课题立项与研究的目的意义（一）XXXX课题立项与研究的目的的意义1、XXXX课题立项与研究的目的意义XXXX课题立项与研究的目的意义四、如表格不够，可以加附页。一、简表项目简况项目名称反向胶团修饰蚯蚓纤溶酶及其性质研究项目类别 B、理科类；申请经费1500元起止年月2005.42006.4项目组成员姓 名性别出生年月年级专业班级所在学院上学年综合测评分项目中的分工本人签字林雪芬女1984.102生物技术1班生命科学学院83.52反胶团EFE的制备王铭铎男1983.502生物技术1班生命科学学院76.42酶学性质研究指导教师情况姓名徐凤彩高向阳性别男女学位博士职称教授副教授研究方向酶工程、生物制药授课名称生物化学、酶工程、生物分离技术项目简介蚯蚓纤溶酶（EFE）是一种丝氨酸蛋白酶，属胰蛋白酶，它不仅具有激活纤溶酶原的类尿激酶活性,还具有直接水解纤维蛋白的纤溶酶活性用。在体外,还能直接溶解天然动物血凝块。本实验从蚯蚓粉中分离纯化出蚯蚓纤溶酶，用表面活性剂在有机溶剂中将酶固定在反胶团的水池中，制成EFE反胶团修饰酶，进行催化作用。比较了表面活性剂类型，表面活性剂浓度，有机溶剂与助溶剂的比例，含水量对反胶团酶体系的萃取和酶活力的影响。在以下条件下建立EFE反胶团体系的效果最好：司盘60浓度为10mg/mL，正庚烷与正丁醇比例为1比1，含水量为150L。比较EFE修饰酶和原酶在热稳定性、pH稳定性、对蛋白酶的抵抗能力等方面的差异。修饰酶的Km为0.3910-4mol/L，原酶的Km为0.5410-4mol/L，原酶和修饰酶都在pH510范围内较为稳定，在3060较稳定。修饰酶的热稳定性和pH稳定性比原酶有所提高，但是提高程度不大。本项目尝试用反胶团对EFE进行修饰，优化条件，在现有条件下建立最佳EFE反胶团催化体系，改善EFE性能，为进一步开发研制治疗血栓病和心血管疾病的新型药物提供基础性的资料。二、项目研究的内容与方法一 技术路线：蚯蚓粉 提取纯化 蚯蚓纤溶酶 反向胶团修饰 修饰酶 性质研究二 材料、试剂和设备1 材料：赤子爱胜蚯蚓粉2 试剂：司盘-60；蔗糖脂肪酸酯；硬脂酰乳酸钠；蒸馏单甘酯；三聚甘油单硬脂酸酯；正丁醇；正庚烷；酪蛋白；三氯乙酸； Sephadex G-50；DEAE-纤维素；苯甲基磺酰氟（PMSF）。3 仪器：752紫外分光光度计；磁力搅拌器；电子天平；高速冷冻离心机；层析柱；自动部分收集仪。三 实验方法1.原酶酶活力测定方法酶液、1%酪蛋白溶液在37水浴中预保温10min，2mL酶液加入1mL1%酪蛋白，摇匀，37保温10min后，加入2mL15% 三氯乙酸终止反应。静置后过滤。滤液在波长280nm下测定吸光值。空白为2mLPBS保温10min后，加入2mL三氯乙酸，摇匀，再加1mL预保温的1%酪蛋白溶液，摇匀，37保温10min，静置过滤的滤液。将在上述条件下在波长280nm下的吸光值每min变化0.001个单位的酶量定义为1个酶活力单位（U）。2.修饰酶酶活力测定方法将反胶团修饰酶于37水浴中保温10min，加入0.4mL预保温10min的1%酪蛋白水溶液。迅速在漩涡混合器上振荡混匀，启动反应。置于分光光度计中，在波长280nm下测在10min内吸光值变化。以3ml上述有机溶液，加入0.1mL蒸馏水，0.4mL 1%酪蛋白水溶液，在漩涡混合器上振荡混匀，于280nm下调零。将在上述条件下，在280nm下吸光值每min变化0.001所需的酶量为一个酶活力单位（U）。3提取和分离纯化蚓纤溶酶。（1）EFE粗酶的制备称取蚯蚓粉，按12（W/V）的比例加入0.1mol/L，pH7.5 PBS，混匀， 4抽提6h，然后以10，000r/min,4离心10min，取上清液；于55水浴保温30min，流水冷却；10000r/min,4离心10min，取上清液；加入硫酸铵达30%饱和度；10，000r/min,4离心10min，取上清液；加硫酸铵达70%饱和度；10000r/min,4 C离心10min，取沉淀；将沉淀溶解于上述缓冲液，对此缓冲液透析过夜；10000r/min,4离心10min，取上清液即为粗酶溶液。（2）EFE的分离纯化取5mL粗酶溶液过Sephadex G-50（3.0cm24.0cm）柱层析，以0.02mol/L，pH7.8 PBS洗脱（1mL/min，4mL/管）。收集活性峰，上DEAE-纤维素离子交换柱层析（1.5cm33.0cm），以含0.10.6mol/L NaCl的0.02mol/LpH7.8 PBS离子强度线性梯度洗脱（0.6mL/min，4mL/管），收集活性峰洗脱液。4制备反向胶团取含表面活性剂的正庚烷/正丁醇溶液2mL于具塞试管中，加入EFE酶液，在漩涡混合器上振荡混匀，形成反胶团酶。比较各种表面活性剂（司盘-60、蔗糖脂肪酸酯、硬脂酰乳酸钠、蒸馏单甘酯、三聚甘油单硬脂酸酯）对反胶团体系形成的影响，正庚烷和正丁醇的比例（1/1，3/1，1/3，V/V）、司盘浓度（2.5、5、10 mg/mL）、含水量（50L、100L、150L、200L和250L）对EFE萃取和酶活力的影响，从而选取最佳组合。5修饰酶与原酶的性质比较（1）用不同浓度底物（酪蛋白）分别测修饰酶和原酶的活性。用lineeweaver-burk作图法，求出Km,Vmax。（2）用不同pH值的酶液，37保温30min，测酶活。（3）将修饰酶和原酶分别在不同温度下保温30min，冷却，37下测酶活。（4）对修饰酶和原酶分别加入各浓度的丝氨酸蛋白酶特异抑制剂PMSF，测酶活。（5）观察修饰酶和原酶在37保温12h对天然凝血块的溶解效果。三、项目研究过程与资料查阅情况一.研究过程1.EFE的提取和分离纯化以赤子爱胜蚯蚓粉为材料，经磷酸缓冲液抽提，热变性、硫酸铵部分沉淀、Sephadex G-50凝胶过滤和DEAE-纤维素离子交换柱层析，得到蚯蚓纤溶酶。纯化结果见表1。表1 EFE分离纯化表纯化步骤 体积 总活力 总蛋白 比活力 纯化倍数 活力回收（mL） （U） （mg） （U/mL） () （%）粗提 3.8 9880 17222 0.57 1 100Sephadex G-50 9 9207 24858 0.34 0.65 93.19DEAE-纤维素 27 8424 5994 1.41 2.45 85.262.制备反胶团修饰酶比较了表面活性剂类型，表面活性剂浓度，有机溶剂与助溶剂的比例，含水量对反胶团酶体系的萃取和酶活力的影响。相对于蔗糖脂肪酸酯、硬脂酰乳酸钠、蒸馏单甘酯、三聚甘油单硬脂酸酯，司盘-60对EFE的萃取较好，且能较好保持酶活力。在以下条件下建立EFE反胶团体系的效果最好：司盘60浓度为10mg/mL，正庚烷与正丁醇比例为1比1，W0为30，即在司盘60浓度为5mg/mL，总体积为2mL的情况下，含水量为150L。在此条件下建立的EFE反胶团体系稳定性较好，能较好保持酶活力。3.修饰酶和原酶的性质比较比较了EFE修饰酶和原酶在Km值、热稳定性、pH稳定性、对蛋白酶的抵抗能力等方面的差异。反胶团酶的Km值为0.3910-4mol/L，原酶的Km值为0.5410-4mol/L，修饰酶对底物的亲和力较原酶稍有提高。在反胶团体系中的EFE能在适当高温和酸碱环境中保持活力，原酶和修饰酶都在pH510范围内较为稳定，在3060较稳定。修饰酶的热稳定性和pH稳定性较原酶稍有提高，但是提高程度不大。在含蛋白抑制剂的环境中，游离EFE和修饰EFE都受到强烈抑制，底物对酶活力的保持起着巨大作用。反胶团酶可能由于表面活性剂的保护，底物的作用并不明显（见图15）。 二.参考文献1王雪英，伍晓斌，徐凤彩.2003.蚯蚓纤溶酶的分离纯化及其部分酶学性质的研究.药物生物技术.10（2）：88-912刘京萍，李金，李洁，等. 2000.反胶团体系中酶催化蔗糖水解反应动力学研究 北京联合大学学报 14(2):75-773朱浩，施鼐，范映辛，等.1998.反相胶束体系中的酶学研究.生物化学与生物物理进展.26（3）：204-2104杨宏顺，陈复生，李红良.2002.反胶束中枯草杆菌中性蛋白酶的活力研究.23（2）：10-145赵亚华，高向阳.2000.生物化学实验技术教程.华南理工大学出版社，40-416徐凤彩，高向阳，王炜军，等.2001.蚯蚓有效营养及药物成分研究进展.华南农业大学学报.22（3）：86-897曹国民，盛梅，高广达. 1998. 反胶团体系中脂肪酶对橄榄油的间歇水解 中国油脂 23(2):37-408郭从容，何志敏，邹超.1999.青霉素酰胺酶在AOT异辛烷反胶团中的稳定性研究.中国医药工业杂志.30（12）：531-5339缪炜 姚松年.1999.卵磷脂反胶束体系中-1,4葡萄糖苷酶的研究.物理化学学报.15(10):930-937四、项目成果完成形式和价值1.用反胶团固定蚯蚓纤溶酶。将表面活性剂溶于有机溶剂和助溶剂，于具塞试管中，加入适量EFE酶液，在漩涡混合器上振荡混匀，形成反胶团EFE。2.确定最佳固定条件。在以下条件下建立EFE反胶团体系的效果最好：司盘60浓度为10mg/mL，正庚烷与正丁醇比例为1比1，W0为30，即在司盘60浓度为5mg/mL，总体积为2mL的情况下，含水量为150L。3.比较修饰酶和原酶的部分酶学性质。修饰酶的Km为0.3910-4mol/L，原酶的Km为0.5410-4mol/L。原酶和修饰酶都在Ph 510范围内较为稳定，在3060较稳定。修饰酶的热稳定性和pH稳定性较原酶稍有提高，但是提高程度不大。在含蛋白抑制剂的环境中，游离EFE和修饰EFE都受到强烈抑制，底物对酶活力的保持起着巨大作用。反胶团酶可能由于表面活性剂的保护，底物的作用并不明显。反胶团体系为酶在有机相中进行催化反应提供了有利环境。酶在反胶团中能提高相对浓度，所处的环境更接近天然细胞内环境，受着表面活性剂和水层的保护，能保持其活性，并降低外界不良环境的影响。本项目尝试用反胶团对EFE进行修饰，优化条件，在现有条件下建立最佳EFE反胶团催化体系，改善EFE性能，为进一步开发研制治疗血栓病和心血管疾病的新型药物提供基础性的资料。五、经费使用情况实验材料费：1000元试剂费：200元检测费：100元其它（易耗品等）：200元共计：1500元六、申请人对该项目研究工作完成后的认识总结首先要查阅相关资料，对该项目有充分的了解，才能着手进行实验。在实验过程中根据实验条件和实验结果对实验的不科学的地方和不实际的地方进行修正。反胶团并不是适合所有的反应，比较适合于油性底物和固体底物的反应。表面活性剂分为阴离子、阳离子和非离子，要根据固定的酶的性质进行选择，不同的表面活性剂对酶的萃取和酶活力都有一定的影响。对表面活性剂的浓度、有机溶剂和助溶剂的比例、含水量都要经过多次实验摸索，先确定一个大概范围，才能具体确定一个好的固定条件。七、指导教师对项目完成情况的意见该