菌种传代、使用、保存操作规程.doc

菌种传代、使用、保存操作规程 菌种传代、使用、保存操作规程1. 目的本文件规定了微生物检验用菌、无菌检验用菌及抗生素检验用菌的接种、保存，传代方法及要求，适用于中心化验室进行检验用菌的接种和传代操作。2. 适用范围适用于中心化验室菌种管理人员进行检验用菌的接种、保存和传代操作。3. 职责菌种管理人员应按本程序的规定操作。4. 参考文件及相关程序B08(02)005 微生物实验室标准管理程序B08(02)019 微生物检验用菌标准管理程序B08(02)020 检验用培养基标准管理程序5. 程序5.1. 对照菌株名称金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26 003铜绿假单胞菌CMCC(B) 10 104生孢梭菌CMCC(B) 64 941枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63 501大肠埃希菌CMCC(B) 44 102白色念珠菌CMCC(F) 98 001黑曲霉CMCC(F) 98 003短小芽孢杆菌CMCC(B) 63 202藤黄微球菌CMCC(B) 28 001乙型副伤寒沙门菌CMCC(B) 50 0945.2. 菌种来源中国药品生物制品检定所提供的冷冻干燥菌种（即安瓿）。5.3. 微生物检验用菌菌悬液的制备5.3.1. 菌种的复苏与传代5.3.1.1. 取备妥的冷冻菌种安瓿，灭菌的毛细滴管、双碟、镊子、注射器、灭菌水及复苏菌种所需的培养基等物品，移入超净工作台。5.3.1.2. 用75%酒精棉球擦净冷冻菌种安瓿外壁，放在灭菌双碟内，待干。5.3.1.3. 点燃酒精灯，将安瓿的封口一端在火焰上烧灼，用灭菌毛细管吸取灭菌水或胰酪大豆胨液体培养基少许在灼热处，使其骤冷,用干燥无菌纱布包裹安瓿，安瓿掰开。5.3.1.4. 在不离开火焰圈内，迅速用注射器抽取约0.5ml胰酪大豆胨琼液体培养基，注入安瓿内，轻轻震摇使冷冻菌块溶解、混匀，随即用注射器吸取安瓿内容物分别接种至1支胰酪大豆胨液体培养基，1支普通胰酪大豆胨胰酪大豆胨琼脂斜面培养基内。5.3.1.5 将接种后的胰酪大豆胨液体培养基以及胰酪大豆胨胰酪大豆胨琼脂斜面置3035恒温培养1824小时。（接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中3035恒温培养1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖培养基中或沙氏葡萄糖营养琼脂培养基上，2328恒温培养2448小时；接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，2328恒温培养57天，加入35ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱制成孢子悬液。）5.3.1.6. 取出培养物，仔细观察菌苔形态，如无杂菌，转接至2支普通胰酪大豆胨琼脂斜面中，于3035恒温培养1824小时，同时作平板分离单个菌落及涂片镜检。5.3.1.7. 镜检呈典型的菌型后，取第1支用灭菌0.9%氯化钠溶液洗下菌苔，加液体石蜡（液体石蜡最终浓度为10%），分装至冻存管中（冻存管1ml/支）于-30条件下冷冻保存；第2支接种至胰酪大豆胨琼液体培养基中，置3035恒温培养1824小时，分装至冻存管中（冻存管1ml/支），加入液体石蜡，于-30条件下冷冻保存，作为工作用试验菌种（也称为工作用菌种）。5.3.1.8. 每次传代应作好记录，工作菌种的标签除标明菌种名称外，还应表明菌种编号，传代次数, 传代日期，传代人，支数（冻存管编号DC02-1211-1-3-01，表示大肠埃希菌2012年11月购买的第一支菌种第3代1号冻存管；复苏菌液编号DC02-1211-1-3-01-00，表示大肠埃希菌2012年11月购买的第一支菌种第3代1号管复苏后的菌液，其中DC02表示大肠杆菌）。5.3.1.9.每半年应对冻存管中每种菌的菌种生长情况进行一次复核试验，并记录。5.4. 斜面接种法5.4.1. 接种前用紫外光照射30分钟以上，并用75%酒精棉球擦拭超净工作台进行灭菌。5.4.2. 准备好需用的培养基斜面，标签上注明菌种名称和接种日期。培养基的制备日期应在2周之内，如斜面已无凝水者不宜再用。5.4.3. 自冰箱中取出菌种斜面，在室外温下放置约20分钟，待温度与室温平衡后，再移入超净工作台。5.4.4. 点燃酒精灯，将菌种管斜面的棉花塞，通过火焰转动使稍稍松动，以便接种时易于拔取；为防止细菌污染，接种操作应在搪瓷方盘上方进行，以防止细菌微粒散落。5.4.5. 再将原来已有的菌种斜面培养基（简称菌种管）与待接种的新鲜斜面培养基（简称接种管），持在左手拇指、食指及中指之间，要注意能清楚观察到斜面，使菌种管在前，接种管在后。应斜持使管呈45度角，使试管内斜面向上，两试管口平齐，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。5.4.6. 右手持接种环的柄端，垂直或稍斜地把接种环置于火焰上（酒精灯外焰）烧灼至烧红约30秒，以彻底灭菌，随后将全部铂金丝及金属棒部分在火焰上烧灼，接种柄一边转动，一边慢慢地来回通过4次，烧灼时，应把接种环置于酒精灯的外焰上。5.4.7. 使用右手的小指和手掌之间以及无名指与小指之间，在火焰旁分别拔出两支试管的棉塞并夹住棉塞，左手将试管口在火焰上旋转烧灼以杀死管口可能沾污的细菌，但勿烧烫。5.4.8. 用右手的拇指、食指和中指操作接种环，将灼烧过的接种环的铂金耳伸入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基，如有熔印，则表明接种环未冷却，能烫死细菌。一定待冷却到室温后，方可从斜面上挑取菌苔少许，随即取出时接种环，在火焰旁迅速插入接种管，在斜面上轻轻划线接种，划线时一般先由下而上划一直线后，再由下而上划“s”形曲线。操作过程应迅速，勿使菌种沾至管壁或管口，只能划动一次，切勿重复移动。如需同时接种几支菌种斜面时，刮一次菌苔后可以连续接各三支斜面。5.4.9. 从菌种管中取出接种环，立即将管口通过火焰灭菌，用右手在火焰旁将菌种管及接种管的棉塞堵上，不要将管口离开火焰旁去迎接右手的棉塞；然后将接种环在火焰上烧灼灭菌，应先将铂金耳离沾有细菌远端的铂金丝烧灼至红，使其传热至铂金耳使铂金耳上残留的菌苔渐枯焦、炭化后，才将铂金耳移至火焰中烧灼至红约30秒（不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间），再消毒接种环的金属部分，使其在火焰上烧灼通过3次。5.4.10. 当接种完毕后，将接种后的普通胰酪大豆胨琼脂斜面培养箱中进行培养，细菌在3035培养1824小时，真菌在2328培养2448小时。取出，置室温约1小时，待温度与室温平衡后放入冰箱（28）内保存，并定期进行传代和接种（菌种斜面每1个月用普通胰酪大豆胨琼脂斜面传代一次，芽孢杆菌每3个月用普通胰酪大豆胨琼脂斜面传代一次，菌种传代不超过5代）。5.5. 工作用菌种（冻存管）的使用5.5.1. 接种前用紫外光照射30分钟以上，并用75%酒精棉球擦拭超净工作台进行灭菌。准备好适宜的培养基，标签上注明菌种名称和接种日期。5.5.2. 自冰箱中取出菌种冻存管，在培养箱复苏约60分钟，待解冻后，移入超净工作台。5.5.3. 点燃酒精灯，用无菌注射器吸出菌液，接种至培养基中，3035培养1824小时。5.5.4. 将上述培养物吸出1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液逐级稀释，制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液，备用。（菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在28可在24小时内使用。） 5.6. 无菌检查用菌菌悬液的制备 按5.3中的工作用菌种冻存管接种方法操作，接种好所需的对照菌株冻存管分别接种至营养琼脂培养基斜面及胰酪大豆胨液体培养基中，将接种后的胰酪大豆胨琼脂斜面及胰酪大豆胨液体置3035恒温培养1824小时。取出培养物，仔细观察斜面菌苔形态，确认无杂菌。（接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌至胰酪大豆胨液体培养基中或琼脂培养基上，接种生孢梭菌至硫乙醇酸盐流体培养基中3035恒温培养1824小时；接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖培养基中或沙氏葡萄糖营养琼脂培养基上，2328恒温培养2448小时） 金黄色葡萄球菌菌液：取金黄色葡萄球菌的胰酪大豆胨液体新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含菌10100个。 铜绿假单胞菌菌液：取铜绿假单胞菌的胰酪大豆胨液体新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含菌10100个。 生孢梭菌菌液：取生孢梭菌的硫乙醇酸盐流体培养基新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含菌10100个。 枯草芽孢杆菌菌液：取枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含菌10100个。 大肠埃希菌菌液：取大肠埃希菌的胰酪大豆胨液体新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含菌10100个。 白色念珠菌菌液：取白色念珠菌的沙氏葡萄糖培养基新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10100个菌。 黑曲霉：取黑曲霉菌的冻存管1支，接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面，在2328培养57天，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。移至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10100个菌。5.7. 抗生素微生物菌悬液的制备 按5.3中的工作用菌种冻存管接种方法操作，接种好所需的对照菌株冻存管。 枯草芽孢杆菌悬液：取枯草芽孢杆菌冻存管1支接种至营养琼脂培养基瓶中，在 3537培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，65加热30分钟，备用。 短小芽孢杆菌悬液：取短小芽孢杆菌冻存管1支接种至营养琼脂培养基瓶中，在 3537培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，65加热30分钟，备用。 藤黄微球菌悬液：取藤黄微球菌悬液冻存管1支接种至营养琼脂培养基瓶中，在2627培养24小时，用0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。5.8. 菌种的保存 工作用菌种（冻存管）置于-30条件下冷冻保存。 菌种斜面置于28保存。 菌悬液置于28保存。6. 环境保护、健康、安全 接种完毕后，应立即用消毒酒精擦拭台面，并用紫外灯照射30分钟以上，防止污染。 菌液及带菌器具应及时放入湿热蒸汽灭菌器中121灭菌30min后再清洗。 在接种进程中，如果棉塞因不慎着火，切勿用口吹，必须在刚刚着火时，迅速将棉塞塞入试管，使棉塞在试管内因氧气不足而很快熄灭。 灼烧带菌接种环时，不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间及操作人员。 如在操作过程中，不小心使细菌溅落，应立即用消毒酒精擦拭被染部位，以防止污染。 假定实验工作衣受污染，应立即脱下翻转包裹，使污染部分包在内部，送往消毒，经灭菌处理后，再洗涤灭菌处理后用。 因偶然打破盛有培养物的器皿，致使病原性的菌毒种外溢，污染了工作室及操作者的衣物及体表时，当事人应冷静，切勿乱动以免扩大污染面。应唤他人用浸透消毒液的毛巾或纱布覆盖于碎片上，或将消毒液2%的甲酚皂或0.2%的新洁尔灭溶液）倒在污染区，浸没一段时间。先从外至内逐步清理污染源，最后将衣物彻底