实验一 鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定.doc

实验一 鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定一、实验目的：通过本实验的学习，掌握蛋白质的提取、分离、纯化及性质测定技术，掌握高速冷冻离心机、可见分光光度计、核酸蛋白检测仪、电泳仪等仪器的使用。二、基本原理：鸡卵类粘蛋白(chicken ovomucoid简称CHOM)是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究。也可将其制成吸附亲合剂，通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。鸡卵类粘蛋白至今还未能获得单一组分的制品，在电泳行为上常呈不均一性。目前至少已获得四种不同的组分，它们在抑制胰蛋白酶的性能上和氨基酸组成上没有多大区别，但是在糖蛋白的糖部分（主要为D-甘露糖、D-半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸）的含量上则有差别。它们的等电点有一定的范围，大致在pH3.94.5。相对分子量28，000。卵类粘蛋白抑制胰蛋白酶克分子比为1：1，因此高纯度的卵类粘蛋白1微克能抑制相当于0.86微克的胰蛋白酶（比活力为12，000BAEE单位/毫克蛋白）。不同来源的卵类蛋白末端基有很大差异，鸡卵类粘蛋白N末端基为丙氨酸（C末端为苯丙氨酸）。卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。鸡卵类粘蛋白除对牛和猪的胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，另外对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。本实验主要参照Kassell所述的方法，先将鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）丙酮溶液处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获得粗品，在经过DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）柱层析纯化而得合格产品。三、试剂与器材3.1粗提所需试剂：丙酮，0.5M三氯乙酸，0.2M pH6.5磷酸盐缓冲液；3.2 纯化所需试剂：0.02M pH6.5磷酸缓冲液，；DEAE-纤维素32或52，0.5M氯化钠-0.5M氢氧化钠溶液，0.5M盐酸，0.02M，pH6.5磷酸盐缓冲液,0.30M氯化钠-0.02M pH6.5磷酸盐缓冲液，1.0 M氯化钠-0.02M pH6.5磷酸盐缓冲液，聚乙二醇8000，蔗糖。3.3 胰蛋白酶活力及粘蛋白抑制活力测定试剂：0.05M pH8.0Tris-HCl缓冲液，BAEE-0.05M,pH8.0 Tris-HCl缓冲液（每毫升Tris-HCl缓冲液含0.34毫克BAEE和2.22毫克氯化钙），结晶胰蛋白酶溶液（0.4mg/mL, 0.1M pH8.0磷酸盐缓冲液配制），0.4M Na2CO3（无水碳酸钠42.4g，无离子水定溶至1000ml），0.4M三氯乙酸（三氯乙酸65.4g，无离子水定溶至1000ml），2%酪蛋白溶液（干酪素5g，用少量0.1M NaOH加热溶解后，0.1M pH6.5磷酸盐缓冲液定溶至250ml），100ug/ml酪氨酸溶液（105烘干2小时的酪氨酸0.1g，用少量0.1M HCl溶解后，无离子水定溶至100ml，即1000ug/ml,取10ml，无离子水稀释至100ml即成100ug/ml）, Folin乙试剂。3.4器材新鲜鸡蛋、透析袋、层析柱（1.0*20cm）、贮液瓶（柱层洗洗脱用）、试管及试管架、广泛试纸、擦镜纸、滤纸（7cm）、移液管（0.5mL，1mL）、冰箱、计时器、恒温水浴锅、紫外分光光度计、可见分光光度计、部分收集器、紫外检测仪（包括记录装置）、高速冷冻离心机、电磁炉、磁力搅拌器。四、操作步骤： （一）粗品的制备：由1枚新鲜鸡蛋大约获得25-30mL蛋清，盛于250mL烧杯内，放置于温水浴锅内使温度达到25-30，在不断搅拌下，缓慢加入等体积4预冷的三氯乙酸丙酮溶液（0.5M TCA与丙酮的体积比为1：2V/V），立即出现大量白色沉淀，加完后最终pH应为3.5，如高于pH 3.5，用0.5M TCA调到pH 3.5,再继续搅拌30 min，然后在4下放置1-2 h,离心(4000 rpm,20 min)，约得25-30毫升黄绿色清液。 边搅拌边加入2倍于上清液体积的4预冷的丙酮，可见白色沉淀产生，在冰箱中放置1-2 h，离心(4000 rpm,20 min)，弃上清液，得沉淀，加入2ml无离子水，溶解沉淀，装入透析袋对水透析以除去残留的TCA，透析过程中有少量沉淀出现，将透析袋中的溶液离心(4000 rpm,20 min)，弃沉淀，将上清液倒入25mL量筒中，加入1/10上清液体积的0.2 M pH6.5磷酸盐缓冲液，摇匀，测量并记录粗品总体积，可供下步上柱纯化之用。（二）纯化： 2.1 DEAE-纤维素的处理及再生： 新纤维素的处理：取50克DEAE-纤维素-32或DE-52（Whatmah进口分装 ），用少量水溶胀1 h，用0.5M氯化钠溶液0.5M氢氧化钠溶液（即1M氯化钠溶液与1M氢氧化钠溶液等体积混合，搅拌处理20分钟、用大量的蒸馏水洗至中性，再用0.5M盐酸与0.5M氯化钠溶液搅拌处理20分钟、用大量的蒸馏水洗至中性，再用0.5M氯化钠溶液0.5M氢氧化钠溶液处理一次，最后用大量的蒸馏水洗至中性，放置冰箱中保存。 旧纤维素的再生：省去酸处理一步，只用0.5M氯化钠溶液0.5M氢氧化钠溶液处理一次，用大量的蒸馏水洗至中性，放置冰箱中保存。2.2 装柱：层析柱垂直安装在铁架台上，夹紧柱下端的硅胶管。先加入1/3-1/2柱体积的水，取一合适大小的玻璃漏斗，安装在柱的上端（使漏斗颈的外径与层析柱的内径吻合，不能使层析柱中的水或缓冲液渗出）。将处理好的DEAE-纤维素连同一些水倒入漏斗，不断搅拌，使之自然沉降到1cm左右的高度，打开柱下端的硅胶管，继续搅拌、沉降至3/4柱高。将柱下短的硅胶管连接在核酸蛋白监测仪样品池的入口。打开核酸蛋白监测仪电源，预热至少30min。2.3平衡：打开蠕动泵，用0.02 M pH 6.5磷酸盐缓冲液平衡层析柱，最少用3倍柱体积的0.02M pH 6.5磷酸盐缓冲液平衡，平衡过程中，调节蠕动泵的流速，记录柱下端流出速度，使之在1-2ml/min之间。始终保持柱床上边最少有2cm高度的缓冲液，注意不能干柱，否则需重新装柱。 平衡过程中，调试核酸蛋白监测仪。首先将旋钮拨到T100%(指透光率)，调“光量”到显示100，再将旋钮拨到 A（吸光度）（A有不同灵敏度，一般选择0.5A），调节“调零”到显示0。继续平衡，如数字有波动，反复调节几次，使A值保持示为0。2.4 上样及洗脱：关掉蠕动泵，打开柱上端的螺扣，将柱床上边的缓冲液吸出，然后立即贴壁加1ml样品（粗提样品），使样品全部缓慢流入层析柱床内，立即加0.02M pH 6.5磷酸盐缓冲液到柱床上边保持2cm高度。拧好柱上端的螺扣，打开蠕动泵，继续以相同的磷酸盐缓冲液进行平衡，观察核酸蛋白监测仪的A值变化情况。当A值急剧上升时，计时，同时以试管收集对应的流出液（核酸蛋白监测仪的样品池出口），每收集2ml，换一支试管，当A值上升到最高值时，计时，下降到数值稳定时，可停止收集流出液，这部分流出液主要为溶菌酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂等杂蛋白。然后改用0.3M氯化钠-0.02M pH 6.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，同样，当A值急剧上升时开始收集，计时，以试管收集对应的流出液（核酸蛋白监测仪的样品池出口），每收集2ml，换一支试管，当A值上升到最高值时，计时，下降到数值稳定时，可停止收集流出液，这部分流出液多为具有抑制胰蛋白酶活性的的卵类粘蛋白，即部分纯化的卵类粘蛋白，纯度相当于一般商品，即1毫克蛋白的产品能抑制近1毫克的胰蛋白酶，比活力为10，000 BAEE单位/毫克蛋白，并含有少量抑制胰凝乳蛋白酶的抑制剂（Chymotrypsin inhibitor）每毫克产品能抑制a-胰凝乳蛋白酶的量小于0.03毫克。收集的部分纯化的卵类粘蛋白可直接用于活性和蛋白质浓度测定，一般情况下，由于实验课时限制，洗脱流速较快，导致洗脱体积过大，需要蔗糖浓缩到2-3ml左右，再对水透析，最大体积不要超过5ml，活力测定前，要对0.1mol/L pH8.0 PB缓冲液透析，透析后测量体积，为纯化后类粘蛋白的总体积。（三）酶活力测定：3.1 BAEE法3.1.1胰蛋白酶的活力测定：以苯甲酰L精氨酸乙酯（benzoyl L-arginine ethyl ejtev简称BAEE）为底物，用紫外吸收法测定。方法如下：取2个石英比色池（带盖，光程为1厘米），分别加入25度预热的2.8毫升BAEE-0.05M pH 8.0 Tris-HcL缓冲液（含氯化钙），然后想一个池中加入0.2毫升0.05M Tris-HcL缓冲液，混合，作为空白对照，调零。另一池加入0.2毫升酶液（用量一般为10微克蛋白的结晶酶），立即混匀并计时，于253nm处测其光密度（增加），每隔半分钟读一次数，共35分钟。若OD/分钟0.400，则酶液需要稀释或减量。根据时间光密度关系曲线中的直线部分，任选一时间间隔与相应光密度值变化（OD），按一下公式计算胰蛋白酶的活力单位和比活力。酶活力单位（BAEE单位）=OD t/t*0.001比活力=酶活力单位/毫克蛋白质=OD t/t*1000/*t*0.001式中OD t/t为任选的时间隔（分）内光密度值的变化（增加），为测定时所用酶蛋白量（微克）；1000为酶蛋白由微克换算成毫克的转换值；0.001为光密度增加0.001定为1个BAEE活力单位的常数。比活力=酶活力单位数/毫克蛋白质=OD t*1000/*t*0.0013.1.2 卵类粘蛋白抑制活性测量：抑制1个胰蛋白酶活力单位（BAEE单位）所需卵类粘蛋白量定为抑制剂的一个活力单位。将卵类粘蛋白和结晶胰蛋白酶按一定比例相互混合，（卵类蛋白量不能超过胰蛋白酶量，一般以1：2较适合，具体视卵类粘蛋白的纯度而异）加入适量的0.05M pH 6.0 Tris-HcL-NaCL缓冲液在25保温10分钟左右，使酶与抑制剂充分结合。然后取适量混合液（相当于原胰蛋白酶10微克左右）按上述方法测出胰蛋白酶活力，由它减去剩余酶活力，即为被抑制的胰蛋白酶活力，也就是卵类粘蛋白的抑制活力。抑制胰凝乳蛋白酶的活力测定方法与上述测定抑制胰蛋白酶的活力相似，仅是用胰凝乳蛋白酶、ATEE代替。3.2 Folin-酚法测定胰蛋白酶的酶活力及卵类粘蛋白的抑制活力 测胰蛋白酶的酶活原理：蛋白酶能催化蛋白质的肽键水解，生成游离氨基酸或小肽。如果蛋白酶的活力大则水解的肽键就多，生成的氢基酸也愈多。测定蛋白酶活力可以采用福林酚试剂与蛋白质水解出来的酪氨酸作用生成蓝色物，在分光光度计上测蓝色物质的OD值，从酪氨酸标准曲线上查出酪氨酸产物的量，再根据酶活力计算公式计算酶活力的大小。 测定粘蛋白抑制活力原理： 由于卵类粘蛋白在碱性条件先能可逆地与胰蛋白酶结合，抑制其活性，抑制比为1摩尔对1摩尔，因此首先测定出一定量的胰蛋白酶活力单位，再以一定量的卵类粘蛋白与胰蛋白酶一起保温一定时间，使卵类粘蛋白充分与胰蛋白酶相互作用，并抑制胰蛋白酶活性，然后测定胰蛋白酶的剩余活力，用胰蛋白酶活力减去胰蛋白酶的剩余活力，就是卵类粘蛋白的抑制活力。3.2.1酪氨酸标准曲线绘制 表1 酪氨酸标准曲线加样表管号1#2#3#4#5#6#标准酪氨酸（ml）00.20.40.60.81.0无离子水（ml）1.00.80.60.40.20酪氨酸浓度（ug/ml）0204060801000.4M Na2CO3（ml）555555Folin乙试剂（ml）11111140水浴20min后，测定A680nmA680nm3.2.2粘蛋白对胰蛋白酶的抑制 使粗品和纯品在pH8.0条件下，充分与胰蛋白酶结合，抑制其活性。1和1：0.5ml胰蛋白酶溶液（trypsin,T）浓度0.4mg/ml+0.5ml pH 8.0 PB buffer;2和2：0.5ml粘蛋白粗品（crude,C）+0.5mltrypsin(0.4mg/ml),40度保温10min;3和3：0.5ml粘蛋白粗品（purified,P）+0.5mltrypsin(0.4mg/ml),40度保温10min;经过抑制之后，按表2所列顺序加样。 3.2.3 胰酶及粘蛋白抑制后对酪蛋白底物的水解表2 胰蛋白酶及粘蛋白抑制后水解酪蛋白底物加样表管号112233样品（ml）1.01.01.01.01.01.040预热5min0.4M三氯乙酸（ml）2.002.002.002%酪蛋白1.01.01.01.01.01.040继续水浴10min，0.4M三氯乙酸（ml）02.002.002.07cm滤纸过滤，得酶促反应滤液表2中管号的含义：1：胰蛋白酶水解底物对照，1:胰蛋白酶水解底物；2:粘蛋白粗品抑制后胰酶水解底物对照，2:粘蛋白粗品抑制后胰酶水解底物；3: 粘蛋白纯品抑制后胰酶水解底物对照，3:粘蛋白纯品抑制后胰酶水解底物。3.2.4 各管酶促反应滤液与Folin-酚试剂反应 表3 上述各管酶促反应滤液与Folin-酚试剂反应加样表112233表2滤液（ml）1.01.01.01.01.01.00.4M Na2CO3（ml）5.05.05.05.05.05.0Folin乙试剂（ml）1.01.01.01.01.01.040水浴20min后，测定A680nmA680nm0?0?0?活力及剩余单位数（U）？粘蛋白抑制活力？ 3.2.5酶活力单位定义及计算公式： 40度下，每min每mL酶液水解干酪素产生1微克酪氨酸所需的酶量，定义为一个酶活力单位U。 计算公式： 酶活力单位OD410 nk OD：1ml酶促反应液测得的OD680； 4：酶促反应体积； 10：酶促反应时间； n：酶液的稀释倍数（本实验中 n为1，各管内含有的胰蛋白酶均为1mL,2mg/ml的胰蛋白酶溶液） k：1个OD值相当于酪氨酸的微克数（对应于每一台分光光度计应有一个不同的标准曲线，因此k值也不同,但k值的范围在90.5-91.5之间，本实验为节省时间取k值为91） 注意事项： 1mL 0.2mg/mL胰蛋白酶溶液，在实验条件下水解酪蛋白产生的酪氨酸，与Folin-酚试剂反应，产物的OD值正好在标准曲线范围内，一般在0.2左右，计算出1mL胰蛋白酶的活力单位数。 纯化总表步骤总体积/ml总蛋白/mg总活力/U比活力U/mg收率纯化倍数丙酮-TCA粗提100DEAE-Cellulose-52（四）蛋白质浓度测定见附录一（五）纯度鉴定及分子量测定见附录二（六）注意事项:（七）思考题： 附录一：Folin-酚法测定蛋白质浓度一、测所需试剂：1、0.1M NaOH：称取0.4g氢氧化钠，无离子水定容至100mL。2、标准蛋白质溶液：称取预先经凯氏定氮法测定蛋白含量（含氮量89%,含水量4%）的酪蛋白292g，用少量0.1M氢氧化钠湿润成糊状，无离子水定容500mL（500g/mL）。3、Folin-试剂A、试剂甲：（1）：4%碳酸纳（Na2CO3）溶液：称取碳酸钠120g，无离子水定容至3000mL。（2）：0.2N氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠24g，无离子水定容至3000mL。（3）1%硫酸铜溶液：称取硫酸铜2g，无离子水定容至200mL。（4）2%酒石酸钾钠溶液：称取酒石酸钾钠4g，无离子水定容至200mL。 临用前将： （1）与（2）等体积配制碳酸钠氢氧化钠无离子水定容至3000mL。溶液，（A） （3）与（4）等体积配制成硫酸铜酒石酸钾钠溶液，（B）然后将A、B两种试剂按50：1的比例混合，即成Folin-酚试剂甲。B、试剂乙：称钨酸钠（Na2WO22H2O）25g、钼酸钠（Na2MoO42H2O）6.25g置500mL磨口回流装置内，加蒸馏水175mL，85%磷酸12.5mL和浓盐酸25mL，充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10小时（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液爆沸），再加入硫酸锂（LiSO4）37.5g，蒸馏水12.5mL及溴水数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至250mL，过滤即成Folin-酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸数分钟，恢复原色仍可继续使用。试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液（1moll/L左右），以酚肽为指示剂，当溶液颜色由红紫红紫灰墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。二、操作步骤：（1）标准曲线的绘制取8支试管，分两组按下表平行操作。1#2#3#4#5#6#标准酪蛋白溶液/mL00.20.40.60.81.0蒸馏水/mL1.00.80.70.60.50.4酪蛋白浓度（g/mL）0100200300400500待测试样品/mL000000Folin-酚甲试剂/mL5.05.05.05.05.05.0混匀，于25水浴10分钟Folin-酚乙试剂/mL0.50.50.50.50.50.5迅速混匀，于25水浴30分钟，以1#做对照，测A640A640（2）待测样品的测定：取两支试管分别以待测样品1.0ml，替代标准蛋白溶液，其他步骤与标准曲线相同。7#8#待测试样品/mL00Folin-酚甲试剂/mL5.05.0混匀，于25水浴10分钟Folin-酚乙试剂/mL0.50.5迅速混匀，于25水浴30分钟，以1#做对照，测A640A640根据样品的A640和标准曲线公式，计算样品的蛋白质浓度。附录二：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量一、实验目的1 了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理2 掌握电泳实验操作规程3 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定蛋白质分子量二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。三、实验材料和试剂1）.胶母液：30%Acr-0.8%Bis贮液，Acr 150 g,Bis 4 g，重蒸水溶解，定容至500 mL。棕色瓶中4保存，可放置1个月左右。2）.10%过硫酸铵（AP）：1 g APS溶于10 mL蒸馏水，4贮存，可用一周。3）.pH8.9Tris-HCI缓冲液：Tris 92 g,1 mol/L HCI 120 mL,TEMED 2.5 ml,10% SDS 3ml加蒸馏水溶解，定容到500 mL。4）.pH6.7Tris-HCI缓冲液：30 g Tris，1 mol/L HCl 240 mL, TEMED 2.5ml,10% SDS 3ml,加蒸馏水溶解，定容到500 mL。5）.pH 8.3 Tris-Gly电极缓冲液：6.0 g Tris，28.8 g Gly，1 g SDS,加蒸馏水溶解，定容到1000 mL。6）.样品液：pH 6.7缓冲液25 mL，甘油10 mL ,10% SDS 10 mL，巯基乙醇1 mL，加溴酚蓝少许，定容到50 mL。8）. 0.05%考马斯亮蓝R250染色液：2.5 g考马斯亮蓝，甲醇250 ml，冰乙酸50 ml，水定容到500 mL。9）.脱色液：7%乙酸溶液。（70 ml冰乙酸，无离子水定容至1000 ml。四、器材 垂直板电泳槽、凝胶模（1351001.0mm）样品梳、直流稳压电源，以上产品皆为北京六一仪器厂生产。吸量管（1，5，10mL）;烧杯（25，50，100mL）；细长头滴管；1mL注射器及6号长针头；微量进样器（10，50L）；真空干燥器；培养皿（直径120mm）；玻璃板（1313cm）；玻璃纸（1818c）四、实验步骤1. 配制SDS聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试剂2电泳 根据厂家说明书安装电泳槽的玻璃板。 配胶：确定所需凝胶溶液体积，在一小烧杯中按表1从上到下的顺序配制分离胶溶液。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速混匀，迅速将凝胶溶液灌注在玻璃板的缝隙内。一般地，使凝胶液面达玻璃板垂直高度的2/3，上面的1/3留待灌注浓缩胶。最后用微量进样器将100uL水加在胶的液面上，约2-3mm厚，以隔绝空气中的氧气，解除对凝胶聚合作用的抑制。表1 10%分离胶的配制总体积5mL7mL30%胶母液(mL)1.652.3pH8.9buffer含SDS 、TEMED(mL)1.251.75无离子水(mL)2.12.9510%APS(uL)4060（3) 待分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。（4） 制备浓缩胶：按表2给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，马上开始聚合。 在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，注意梳子的正反面，小心避免混入气泡，再将剩余的浓缩胶溶液填满梳子之间的空隙，室温放置待凝。表2 3.6%浓缩胶的配置总体积2mL30%胶母液(mL)0.24pH8.9buffer含SDS 、TEMED(mL)0.5无离子水(mL)0.910%APS(uL)30（5）在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，将待电泳分析的样品（本实验样品为鸡卵类粘蛋白粗品、鸡卵类粘蛋白纯品、标准蛋白质Marker）。每一组用一块凝胶，凝胶中间的点样孔点Marker和BSA，左侧点样孔点粘蛋白粗品，右侧点样孔点粘蛋白纯品。分别取1、2支1.5mL离心管，先各加入粘蛋白粗品和纯品150uL，按样品:样品处理液（体积比）= 1:1的比例加入样品处理液150uL，混匀，在100水浴加热3min，以使蛋白质充分变性并与SDS结合，加样顺序及加样量见表3。注意，Marker和BSA两管也和样品同时沸水浴3min。表三 点样顺序及点样量点样孔12345678910样品粗品粗品粗品粗品MarkerBSA纯品纯品纯品纯品点样量（uL）15105210205101520（6）浓缩