最终滑帆大论文修改6.4.doc

硕士学位 毕业 论文 相同基因型大白菜基于不同倍性水平 的生物学性状及基因表达研究 学位申请人 滑 帆 指导教师 申书兴 教授 顾爱侠 副研究员 学科专业 蔬菜学 学位类别 农学硕士 授予单位 河北农业大学 答辩日期 二 一四年五月三十一日 分类号 S634 1 单位代码 10086 密 级 公开 学 号 2011288 相同基因型大白菜基于不同倍性水平 的生物学性状及基因表达研究 Research on the biological character and gene expression of different ploidy Chinese cabbage with the same genotype 学位申请人 滑 帆 指导教师 申书兴 教授 顾爱侠 副研究员 学科专业 蔬菜学 学位类别 农学硕士 授予单位 河北农业大学 答辩日期 二 一四年五月三十一日 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得 河北农业大学河北农业大学 或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意 学位论文作者签名 签字日期 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 河北农业大学河北农业大学 有关保留 使用学位论文的规定 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借 阅 本人授权河北农业大学河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 导师签名 签字日期 年 月 日 签字日期 年 月 日 学位论文作者毕业后去向 工作单位 电话 通讯地址 邮编 摘 要 以本实验室特有的大白菜 85 1 单倍体为试材 通过秋水仙素对其进行诱导 经细胞学鉴定 DNA 流式细胞仪鉴定获得了相同基因型二倍体 四倍体大白菜植株 对相同基因型大白菜单倍体 二倍体 四倍体进行了植株特征特性调查 细胞形态 学观测等 比较了相同基因型不同倍性大白菜在生物学特性方面的差异 同时利用 实时荧光 PCR 技术开展了对控制大白菜器官大小的 ARGOS 基因 与同源染色体联 会相关的 ASY1 基因在单倍体 二倍体 非整倍体和四倍体植株间基因表达水平的 研究 进而分析了不同倍性大白菜特性与相关基因表达的关系 主要研究结果如下 1 浓度 0 2 秋水仙素处理大白菜单倍体组培苗 48 h 得到二倍体的诱导率为 13 72 且处理后植株长势良好 选用此处理浓度和时间对单倍体大白菜 85 1 进行诱导 获得了相同基因型的单倍体 二倍体 四倍体植株 2 以来自于同一单倍体的二倍体大白菜为母本与四倍体大白菜杂交 取授粉后 8d 的子房在改良 White 中进行离体培养获得了成活胚珠 将成活的胚珠接于 1 2MS 培养基上培养 30 d 后得到再生植株 根尖染色体计数结果表明 获得的植株为非 整倍体大白菜 2n 24 3 相同基因型的单倍体 二倍体 非整倍体和四倍体大白菜在植株性状 细胞 学形态方面均表现出差异 随着染色体数目的增加 单倍体 二倍体 非整倍体 四倍体叶片呈增加的趋势 与单倍体植株花器官相比 二倍体 四倍体以及非整倍 体植株花蕾和花瓣明显增大 花瓣形状为倒卵形 单倍体花药较小 有少量或无花 粉 二倍体 四倍体花药正常 且均有花粉 4 利用实时荧光 PCR 对相同基因型的单倍体 二倍体 非整倍体和四倍体大 白菜叶片 花蕾中的的 ARGOS 基因进行基因表达差异的研究 结果表明 在叶片 和花蕾中 ARGOS 基因的表达量 均随着倍性的增加呈非线性增加的趋势 与不同 倍性大白菜叶片 花器官大小变化趋势一致 相对于二倍体大白菜叶片 ARGOS 基 因表达而言 单倍体叶片 ARGOS 基因表达量最低 仅为二倍体表达量的 0 451 倍 四倍体叶片 ARGOS 基因表达量最高 为二倍体表达量的 2 144 倍 而非整倍体 2n 24 的表达量是二倍体的 1 580 倍 相对于二倍体大白菜花蕾 ARGOS 基因表 达而言 单倍体花蕾 ARGOS 基因表达量仅为二倍体表达量的 0 233 四倍体花蕾 ARGOS 基因表达量最高 为二倍体表达量的 2 457 倍 而非整倍体 2n 24 的表 达量高于二倍体 为二倍体的 1 812 倍 5 利用实时荧光 PCR 对相同基因型的单倍体 二倍体 非整倍体和四倍体大 白菜的 ASY1 基因进行基因表达差异的研究 结果表明 ASY1 基因在大白菜叶片中 不表达 同一时期 不同倍性大白菜花蕾中 二倍体 ASY1 基因的表达量最高 四 倍体次之 单倍体和非整倍体较低 同一材料 花蕾减数分裂期前和成熟花粉粒期 ASY1 基因表达量较减数分裂期明显下降 且减数分裂期前和成熟花粉粒期 ASY1 基 因的表达量接近 关键词 相同基因型 不同倍性 大白菜 生物学性状 基因表达 Research on the biological character and gene expression of different ploidy Chinese cabbage with the same genotype Author Hua Fan Major Olericulture Tutor Shen Shu xing Gu Ai xia College of Horticulture Agricultural University of Hebei Baoding China 071001 Abstract One genotype of haploid Chinese cabbage 85 1 was induced by colchicine to produce diploid and tetraploid plants The ploidy levels of above plants were identified by cytological characters and flow cytometry We investgated the plant characteristics and cell morphologies and compared the differences in biological characteristics of haploid diploid and tetraploid plants derived from a same genotype The real time fluorescent PCR technology was used to study the expression levels of ARGOS gene related to the size of Chinese cabbage organ and ASY1 gene related to the confederation of homologous chromosomes The main results are listed as follows 1 The same genotype of haploid and tetraploid cabbages were obtained The haploid seedlings of Chinese cabbage were treated by 0 2 concentration of colchicine with 48 hours resulting in healthy diploid plants with inducement ratio of 13 72 Using above treatment the haploid diploid and tetraploid Chinese cabbages derived from a same genotype were obtained 2 By embryo rescue techniques in improved White culture medium the survived ovules were got from ovaries after 8 days pollination that were derived from crossing between diploid as male and tetraploid as female After 30 days culture in 1 2 MS medium for the survived ovaries the produced regeneration plants were identified as aneuploidy Chinese cabbage 2 n 24 by counting chromosomes of root tip 3 There were differences in plant trait and cytology morphology among different ploidy plants with the same genotype of Chinese cabbage With the increase of chromosome number the leafy number of haploid diploid aneuploidy tetraploid was increased Compared with the flower organ of haploid plants buds and flower petals of diploid tetraploid and aneuploid plants were increased clearly in size and the petals shape was obovate The anther of haploid was small with little or without pollens while anthers of diploid and tetraploid were normal with pollens 4 The gene ARGOS expression in leaf and flower bud of haploid diploid aneuploid and tetraploid with the same genotype was detected by the real time PCR The results showed that with the increase of ploidy level the gene ARGOS expression was increased in nonlinear with the same trend as variation in leaf and flower organ size The gene ARGOS expression in leaf of haploid was lowest among different ploidy plants with only 0 451 times of expression quantity in diploid the expression quantity in tetraploid plant was the highest with 2 144 times of in diploid while the expression in aneuploid 2 n 24 was 1 580 times of in diploid In flower bud the gene ARGOS expression level in haploid was 0 233 times of in diploid the expression quantity in tetraploid plant was the highest with 2 457 times of in diploid while the expression in aneuploid 2 n 24 was higher than in diploid with 1 812 times of in diploid 5 The gene ASY1 expression in leaf and flower bud of haploid diploid aneuploid and tetraploid with the same genotype was detected by the real time PCR The results showed that the gene ASY1 was not expressed in Chinese cabbage leaf at the same period its expression in diploid was the highest its expression in haploid and aneuploid were lowest for a same genotype the expression before meiosis and in mature pollen was similar and was lower than in meiosis stage Key words The same genotype Different ploidy Chinese cabbage Biological character Gene expression 目 录 1 引言 1 1 1 多倍体的产生与鉴定 1 1 1 1 多倍体的产生途径 1 1 1 2 多倍体的鉴定 3 1 2 不同倍性植株特征特性研究 4 1 3 不同倍性作物基因表达水平研究 4 2 相同基因型不同倍性大白菜的获得与鉴定 6 2 1 试验材料 6 2 2 研究内容与试验方法 6 2 2 1 相同基因型不同倍性大白菜的获得 6 2 2 2 相同基因型不同倍性大白菜的鉴定 7 2 2 3 相同基因型不同倍性大白菜性状的调查 7 2 3 结果与分析 7 2 3 1 二倍体 四倍体大白菜的获得 7 2 3 2 相同基因型大白菜二倍体 四倍体杂交 8 2 3 3 倍性鉴定 9 2 3 4 相同基因型不同倍性植株特征特性的调查 11 3 相同基因型不同倍性大白菜 ARGOS 基因表达差异的研究 14 3 1 试验材料 14 3 2 研究内容与试验方法 14 3 2 1 取材 14 3 2 2 试剂及主要仪器 14 3 2 3 试验方法 14 3 3 结果与分析 17 3 3 1 所提总 RNA 检测结果 17 3 3 2 引物 17 3 3 3 叶片 ARGOS 基因表达差异分析 17 3 3 4 花蕾 ARGOS 基因表达差异分析 19 4 相同基因型不同倍性大白菜 ASY1 基因表达差异的研究 22 4 1 试验材料 22 4 2 研究内容与试验方法 22 4 2 1 材料处理 22 4 2 2 试剂及主要仪器 22 4 2 3 试验方法 22 4 3 结果与分析 23 4 3 1 所取花蕾大小及相对应时期 23 4 3 2 引物 23 4 3 3 叶片 ASY1 基因表达差异分析 24 4 3 4 花蕾 ASY1 基因表达差异分析 24 5 讨论 29 5 1 秋水仙素诱导分析 29 5 2 二倍体与四倍体杂交获得非整倍体 29 5 3 大白菜 ARGOS 基因表达量分析 29 5 4 ASY1 基因表达量分析 30 6 结论 31 参考文献 32 在读期间发表的学术论文 36 作者简历 37 致 谢 38 缩略词表 Abbreviations 缩略符号 Abbreviation 英文全称 Full name in English 中文名称 Name in Chinese BABenzylaminopurine苄氨基腺嘌呤 bpBase Pair 碱基对 cDNACompiementrary DNA 互补 DNA CHCasein Acid Hydrolysate水解酪蛋白 dNTPDeoxyribo Nucleoside Triphosphat脱氧核糖核苷三磷酸 EDTAEthylene Diaminetetracetic Acid乙二胺四乙酸 MSMurashige and SkoogMS 培养基 NAA1 Naphthaleneacetic Acid萘乙酸 PCRPolymerase Chain Reaction聚合酶链式反应 qPCRReal time Quantitative PCR Detecting System 实时荧光 PCR TaqDeoxyribo Nucleoside TriphosphatDNA 聚合酶 TBEThermos aquaticus DNA polymeraseTBE 缓冲液 TrisTrihydroxymethy1 Aminomethane三羟甲基氨基甲烷 RNARibonucleic Acid核糖核酸 相同基因型大白菜基于不同倍性水平的生物学性状及基因表达研究 1 1 引言 1 1 多倍体的产生与鉴定 1 1 1 多倍体的产生途径 1 1 1 1 自然产生多倍体 自然产生多倍体有两种途径 自然环境诱导加倍和细胞染色体加倍 自然条件 下 由于环境的异常 如空气 温度等剧烈变化 可以产生多倍体 1 40 条件下 将授粉后的玉米存放 24 h 后 对其后代进行鉴定后发现存在一定比例的四倍体 八 倍体突变苗 2 国外也有研究发现 40 高温下将小麦的幼胚短暂暴露就可以诱导 形成多倍体幼苗 3 有后绿标志的自然突变体 C899 J2 四倍体甜瓜 就是从二倍体 甜瓜品种 Planters Jumbo 发现的 4 5 细胞染色体加倍的途径主要分为体细胞染色体加倍和天然有性杂交后染色体加 倍 1 3 体细胞染色体加倍主要是由于有丝分裂异常引起的 自然条件下处于有丝分 裂的细胞由于不能形成纺锤丝 导致染色体不能被牵引移到细胞的两极 从而导致 染色体加倍 体细胞染色体加倍后 可能形成嵌合体 也可能形成完全的多倍性孢 子体 6 天然有性杂交导致的染色体加倍现象主要有多精受精和未减数配子融合两种途 径 3 多精受精是指多个精子同时进入了卵细胞的现象 这种现象在向日葵等多种 植物中均有发现 7 未减数配子也称2 n配子 是指小孢子和大孢子发生期 由于减 数分裂异常形成的不正常配子 未减数配子受精结合后 合子染色体数量加倍从而 形成多倍体 1 1 1 2 人工诱变产生多倍体 自然条件下可以产生多倍体 但其变异率很低 不能被广泛地利用 人工诱变 可以解决这个问题 人工诱变产生多倍体的方法有很多 主要有 物理诱变法 化 学诱变法 体细胞无性变异途径 组织培养结合化学诱变法 体细胞杂交法 8 常用的物理方法主要是辐射 高速离心力 异常高温 高真空 机械创伤等 辐射主要是各种射线 X 射线 Y 射线 P 射线 中子 紫外线等 辐射诱导危害 性较大 诱导效率低 嵌合率高 这主要是因为辐射会引起染色体的断裂 损伤 丢失等 9 太空搭载诱变也是诱导多倍体产生的一种途径 太空特殊的 地面无法 模拟的环境 高真空 宇宙高能离子辐射 宇宙磁场 高洁净 可以产生诱变作用 但其重复性较差 稳定性不高 难以在实践中应用 人工诱导剂的种类有很多 主要有 秋水仙碱 乙醚 氟乐灵 水合三氯乙醛 哥罗仿等 10 其中秋水仙素使用最多 效果较好 秋水仙素是百合科植物秋水仙中 河北农业大学硕士学位 毕业 论文 2 含有的一种植物碱 其化学式为 C22H25O6N 秋水仙素主要作用时期是细胞分裂中 期 它可以破坏中期时纺锤丝的形成 使得一分为二的染色体不能移向细胞两极 使得应为两个细胞的染色体不能被分开 从而形成染色体加倍的细胞 秋水仙素诱导植株加倍的主要方法有 浸种法 滴生长点法 生长点涂抹法等 用同一浓度秋水仙素进行诱导加倍 诱导效率随着处理时间的增加而提高 当处理 时间相同时 诱导效率随着秋水仙素浓度的增加而提高 11 但是随着处理时间和处 理浓度的增加 植株受伤程度加剧 植株成活率下降 12 13 这一方面与秋水仙素对 植株的毒性有关 另一方面是由于诱导过程中产生了高倍体和非整倍体 使得植株 死亡 14 因此诱导的关键是获得较高诱导率的同时保证植株正常生长 选择最适合的处理浓度和处理时间可以高效诱导多倍体的产生 用浓度为 0 2 的秋水仙素处理辣椒幼苗 获得了较高诱导率的四倍体植株 15 对二倍体西瓜进行 秋水仙素滴生长点处理 得到了多倍体西瓜 且变异株率为 50 以上 16 刘惠吉等 用秋水仙素处理白菜幼苗 得到了四倍体白菜和耐寒四倍体黑菜 17 18 研究表明通 过对大白菜生长点的处理也获得了同源四倍体大白菜 19 组织培养过程中 无性系变异会出现自然加倍从而获得多倍体再生植株 关于 体细胞无性变异获得多倍体的研究很多 Adelberg 等从来源于子叶 真叶 原生质 的甜瓜愈伤组织的再生植株中获得了大量的四倍体甜瓜植株 20 21 在甜瓜组织培养 过程中 四倍体细胞所占比例增加 四倍体再生植株约占再生植株总数的三分之一 22 23 对西瓜子叶进行离体培养时 在芽再生培养基中加入 BA 后会诱导产生四倍 体 且诱导频率可达到 40 50 24 对自交后 30 d 的黄瓜未成熟种子进行离体培养 可以得到四倍体植株且诱导率为 23 7 马国斌 25 等对西瓜和甜瓜外植体进行离体 培养也获得了较高频率的四倍体植株 利用组织培养和化学诱变结合的方法诱导多倍体 诱变条件易于控制 可以反 复大批量处理植株 并且能够有效地减少异倍性嵌合体产生 成功率较高 26 27 另 外 利用组织培养和化学诱变结合的方法诱导多倍体 倍性鉴定更简便易行 选出 的多倍体植株可以迅速进行大量繁殖 且繁殖的种苗具备无病虫害 质量好 纯度 高等优点 因此组织培养结合化学诱变法有着十分广阔的前景 28 组织培养结合化学诱变法中应用最多的是组织培养过程中利用秋水仙素对组培 苗进行诱导 主要有组织培养中用秋水仙素处理材料和在加有秋水仙素的培养基中 培养材料两种方法 29 在组织培养条件下 将金荞麦无菌苗浸泡于秋水仙素溶液中 或是接于含有秋水仙素的培养基上一段时间后 均诱导产生了金荞麦多倍体植株 且浸泡法诱导率最高可以达到 43 4 28 体细胞杂交法即原生质体融合法 通过人为条件控制 使基因型不同的两个细 胞原生质体进行融合从而获得具有重组子的过程 融合后的重组中同时具有双亲的 染色体组 随着原生质体融合技术的成熟 利用体细胞杂交的方法培养多倍体已经 可以实现 原生质体融合的方法克服了植物远缘杂交障碍 是创制多倍体的一种途 径 3 相同基因型大白菜基于不同倍性水平的生物学性状及基因表达研究 3 1 1 2 多倍体的鉴定 1 1 2 1 间接鉴定 多倍体植株由于染色体组的加倍 引起了植株形态和生理上的变化 因此可以 根据植株的特征特性来间接鉴定倍性 周元昌 30 以抱子甘蓝的花培苗群体作为材料 通过形态学鉴定法将群体中的单倍体与二倍体 四倍体与其它倍体分开 参照 DNA 流式细胞仪鉴定的结果 分析得出用苗期形态学鉴定法鉴定倍性 准确率可以达到 94 2 间接鉴定法还可以通过植物的解剖特征 生理生化指标 细胞水平 分子水 平鉴定等方法进行 29 施先锋 31 通过观察叶片气孔的保卫细胞数目鉴定西瓜染色体 的倍性 准确率可以达到 90 2 通过间接方法鉴定植物倍性的方法较为简便 快速 且成本较低 但仍有部分 植株不能准确地被鉴定出来 因此 间接鉴定法常被用来作为辅助鉴定倍性的方法 1 1 2 2 直接鉴定 间接鉴定可初步筛选出多倍体 但是要进一步证实确定倍性还需要依靠直接鉴 定的方法 染色体计数与组型分析是鉴定染色体倍性的传统方法 通过观察植物根 尖生长点细胞 花粉母细胞的染色体数目来确定植物的倍性 染色体计数法是最为 可信的鉴定倍性的方法 但要达到准确鉴定倍性的目的 对染色体制片以及取材时 间 部位等技术环节要求较高 若需要对大量样品进行鉴定时 这种方法就表现出 了很大的局限性 32 流式细胞术 Flow Cytometry 是 20 世纪发展起来的一种技术 由于倍性的增 加 细胞内 DNA 含量成倍性增加趋势 因此可以用来快速鉴定倍性 流式细胞仪 测定法不受取材的限制 灵敏度高 准确性高 测试速度快 可以用来测定大量的 样品 目前流式细胞仪测定法已经普遍应用于菊花 33 辣椒 34 苹果 35 黑麦草 32 等植株倍性的鉴定上 1 1 2 3 本研究中相同且纯合基因型的不同倍性大白菜的获得与鉴定 本研究以游离小孢子培养获得大白菜单倍体植株为材料 进一步利用秋水仙 素诱导 二倍体与四倍体杂交的方法 以创制来自同一单倍体的相同且纯合基因 型的不同倍性大白菜 利用叶片保卫细胞大小 流式细胞术和根尖染色体计数的 方法对不同倍性材料进行鉴定 获得了相同且纯合基因型的单倍体 二倍体 非 整倍体 四倍体大白菜 最大化消除了基因型差异和杂合基因等对研究不同倍性 材料间差异造成的影响 河北农业大学硕士学位 毕业 论文 4 1 2 不同倍性植株特征特性研究 随着染色体数目成倍的增加 不同倍性材料的核质比例会发生变化 基因的互 作效应 剂量效应等会破坏原有的生理生化平衡 使得不同倍性植株在器官大小 形态发生 遗传特性等方面产生变化 36 梅林 37 等通过对不同倍性盏菊的细胞学 形态学研究发现 二倍体灯盏菊和四 倍体灯盏菊在细胞特征和形态学特征上存在着显著的差异性 四倍体灯盏菊的气孔 较二倍体的气孔明显变大 且在形态上表现出巨大性 如四倍体灯盏菊的株高 叶 片大小 花瓣大小均表现出巨大性 刘文革 38 等对二倍体 三倍体 四倍体西瓜叶 片单位面积上的气孔数量进行了统计 结果表明单位面积上的气孔数二倍体最多 四倍体最少 而三倍体介于两者之间 晏春耕 39 等对不同倍性的单倍体 二倍体 三倍体 四倍体苎麻材料的生物学特性进行了观察 发现随着倍性的增加平均分株 数与蔸的比呈减少的趋势 茎的平均粗度呈增大的趋势 平均高度单倍体最矮 三 倍体最高 二倍体和四倍体介于两者之间 生长势以单倍体最弱 三倍体最强 抗 寒性以单倍体和三倍体最弱 其次是二倍体 抗寒性最强的是四倍体 王镇 40 等对 二倍体和同源四倍体西瓜的农艺性状进行了比较 结果表明 同源四倍体西瓜叶面 积与二倍体的叶面积相比显著增大 果实可溶性固形物含量和番茄红素的含量均有 所增加 不同倍性作物的抗性也不同 刘雪松 41 等对二倍体 三倍体 四倍体的杨桃抗 性进行了研究 结果表明 三倍体杨桃抗寒性最强 四倍体次之 二倍体抗寒性最 弱 在 40 高温的条件下 二倍体 四倍体杨桃的抗热性差异不大 且抗热性均强 于三倍体杨桃 刘文革 42 等对不同倍性西瓜抗枯萎病情况进行了研究 通过将枯萎 病菌接种到相同基因型不同倍性的西瓜材料中发现 二倍体西瓜最先受到枯萎病菌 侵染最先发病 而同源三倍体西瓜和同源四倍体西瓜的发病率均低于同源二倍体西 瓜 1 3 不同倍性作物基因表达水平研究 不同倍性作物基因表达变化的研究主要在集中在异源多倍体的研究上 异源多 倍体基因表达变化主要包括基因沉默 基因激活 在对拟南芥异源四倍体 43 44 小 麦 45 棉花 46 等研究中均发现了基因沉默现象 基因激活是指沉默的基因在异源多 倍体中被激活后重新表达 异源多倍化后可以激活蛋白质编码基因 反转座子等相 关基因 从而影响基因的表达水平 同源加倍化后多倍化体中基因表达上调和下降的现象比较普遍 47 以同源的单 倍体 二倍体与四倍体马铃薯为材料 在 9000 个检测位点中 约有 10 的位点在倍 性系列中的表达发生了改变 48 利用 cDNA 芯片技术 分析合成的菘蓝 49 发现 4 2 的基因表达发生了变化 利用 cDNA AFLP 技术分析薄叶向日葵二倍体 四倍 体 六倍体基因表达变化时发现 有 6 6 基因表达发生了变化 50 相同基因型大白菜基于不同倍性水平的生物学性状及基因表达研究 5 对于同源多倍体中基因表达变化的原因 有些学者提出倍性对基因表达的影响 主要是通过基因组效应 剂量补偿来实现的 51 52 即通过感受基因组剂量的改变调 控基因的表达 53 然而 在同源多倍体中由基因组剂量效应引起基因表达变化的位 点远少于异源多倍体 基因的剂量效应似乎并不明显 54 例如 在白菜的单倍体 二倍体和同源四倍体系列中 蛋白质的双向电泳图谱在不同倍性材料间差异不明显 55 也有学者提出加倍后遗传物质增加 不同倍性 DNA 甲基化存在着不同 DNA 序列的重复以及 DNA 序列之间的相互作用是引起 DNA 甲基化模式改变的主要原因 56 DNA 甲基化模式的改变可以使基因沉默或者开启 从而影响基因的表达 然而 同源加倍后基因沉默或开启的现象尚没有确凿的证据 同源加倍后基因沉默或开启 现象还需要深入研究 47 目前 相对于异源多倍体 同源多倍体基因表达的研究非 常滞后 47 同源多倍体在一些重要基因上 可以通过改变冗余拷贝的表达水平而达 到基因功能多样化 57 基因组同源加倍的过程从长远来看可能具有重要的意义 58 同源多倍体基因表达的研究对我们了解植物进化机制 推动育种发展有非常重要的 意义 许多研究表明不同倍性材料间器官大小存在着明显差异 37 39 梅林 37 等通过对 不同倍性盏菊的形态学调查发现 四倍体灯盏菊较二倍体的株高 叶片大小 花瓣 大小均表现出巨大性 植物器官的大小虽受外界环境的影响 但是它的大小受严格 的遗传控制 59 相关基因的过量表达或不表达可以改变植物器官大小 60 ARGOS 基因是控制器官大小的相关基因 ARGOS 基因的正义表达可以使植株器官增大 ARGOS 基因的反义表达可以使植株器官减小 59 61 这是由于 ARGOS 基因可以通过 改变细胞数目 器官持续生长的时间从而改变器官大小 62 将从大白菜中分离出的 ARGOS 基因转入拟南芥中使其过量表达 结果发现拟南芥地上器官明显增大 59 为 了进一步确认转基因拟南芥叶片细胞大小和体积的具体变化 王保 62 通过扫描电镜 分析发现转基因拟南芥的叶片上表皮细胞数目有所增加 细胞体积也增大了 不同倍性材料间细胞减数分裂染色体行为存在着差异 刘富强等 63 通过对单倍 体大白菜减数分裂分析得出 大白菜单倍体减数分裂不规则 中期 单价体游离于 赤道板附近或排列在赤道板上可见 1 2 个局部联会的二价体或 1 个局部联会的三价 体 刘富强等 64 通过对四倍体大白菜减数分裂行为进行观察得出 四倍体减数分裂 行为较二倍体的复杂 终变期每个同源组的 4 条染色体或联会成四价体或 2 个二价 体或 1 个三价体和 1 个单价体 中期 二价体 四价体和三价体排在赤道面上 单 价体游离在赤道面周围 ASY1 ASYNAPTIC 1 基因是减数分裂过程中控制同源染 色体联会的重要基因之一 ASY1 基因的同源基因在酵母中表达缺失会使得酵母减数 分裂重组力降低 孢子败育 65 拟南芥 asy1 突变体减数分裂中期同源染色体大部分 以单价体的形式存在 且交换率很低 这与减数分裂前期同源染色体不能正常联会 有关 66 目前国内外对 ASY1 基因的报道研究还比较少 主要集中于酵母和拟南芥 上 本研究从不同倍性大白菜器官大小存在明显差异入手 研究不同倍性大白菜 ARGOS 基因在不同组织部位的表达 及其在不同倍性大白菜间的表达差异 分析 河北农业大学硕士学位 毕业 论文 6 其表达量与器官大小等性状的作用关系 从不同倍性大白菜花蕾减数分裂时期染 色体的同源联会行为存在着明显差异入手 研究不同倍性大白菜 ASY1 基因在不同 组织部位的表达 及其在不同倍性大白菜间的表达差异 分析 ASY1 基因在不同倍 性大白菜间的表达差异与减数分裂染色体联会行为的关系 相同基因型大白菜基于不同倍性水平的生物学性状及基因表达研究 7 2 相同基因型不同倍性大白菜的获得与鉴定 2 1 试验材料 大白菜 85 1 单倍体组培苗 由河北省蔬菜种质资源创新与利用重点实验室提供 2 2 研究内容与试验方法 2 2 1 相同基因型不同倍性大白菜的获得 2 2 1 1 秋水仙素的配制 分别称取 0 045 g 和 0 09 g 秋水仙素溶于 45 mL 的无菌水中 配成质量浓度分 别为 0 1 和 0 2 的秋水仙素溶液 并进行高温灭菌 2 2 1 2 二倍体 四倍体大白菜的获得 以大白菜单倍体组培苗为材料 于 6 7 片叶时 在超净工作台上用镊子将已浸 泡过秋水仙素 质量浓度分别为 0 1 0 2 的棉球小心放在生长点上 分别处理 48 h 72 h 后 在超净工作台上切取浸泡过秋水仙素的生长点 用无菌水反复冲洗 3 次 转接到正常的 MS 培养基上培养 培养条件 温度为 25 1 光照 14 h 黑暗 10 h 光照强度为 5500 lx 以秋水仙素诱导获得大白菜植株为材料 筛选 大白菜二倍体 四倍体植株 2 2 1 3 二倍体与四倍体大白菜杂交 杂交杂交 以来自单倍体植株加倍后获得二倍体大白菜为母本 授以来自于同一二 倍体的四倍体大白菜的花粉 套袋隔离 对授粉的时间进行记录 同时进行反交 子房培养子房培养 分别取授粉后 6 d 8 d 10 d 的子房 在超净工作台上对其进行表 面消毒 70 的酒精表面消毒 30 s 0 1 的升汞处理 10 min 表面消毒后 用无菌 水反复冲洗 3 次后接于改良 White 培养基上培养 24 d 胚珠培养胚珠培养 子房培养 24 d 后 在超净工作台上剥出 将成活的胚珠转接于 1 2MS 培养基上培养 温度为 25 1 光照 14 h 黑暗 10 h 光照强度为 5500 lx 条件下培养 30 d 后获得再生植株 河北农业大学硕士学位 毕业 论文 8 2 2 2 相同基因型不同倍性大白菜的鉴定 2 2 2 1 叶片保卫细胞大小的观察 于上午 9 00 10 00 点 取组培苗相同部位叶片 对其保卫细胞大小进行观察 取干净的玻璃载片 在其中间滴一滴清水 用镊子撕取叶片表皮放到载玻片的水滴 中央 加盖盖玻片 在 40 倍光学显微镜下观察 2 2 2 2 流式细胞仪倍性鉴定 采用流式细胞仪分析成活植株的染色体倍性 选取待测定材料幼嫩的叶片 0 5 g 放于直径为 5 cm 的小培养皿中 加入 2 mL 的提取缓冲液 15 mol L Tris HCL pH7 5 80 mol L KCL 20 mol L NaCL 20 mol L EDTA Na 15 mol L 巯基乙醇 0 05 的 TritonX 100 用刀片将其捣碎 过滤后进行离心弃去上清液 收集沉淀细 胞 加入 2 mL 染色缓冲液 常温下避光染色 30 min 过滤后收集滤液 上机测定 Cell Lab Quanta SC 分析仪自动测定和记录 DNA 含量的分布曲线 2 2 2 3 根尖染色体数目的鉴定 将相同基因型不同倍性大白菜组培苗转接到生根培养基上培养 当组培苗的根 长到 1 5 cm 左右时 于上午根尖细胞处于旺盛分裂时期时切下根尖 将切下的根尖 放入 0 002 mol L 的 8 羟基喹啉中处理 2 h 然后转到卡诺固定液中固定 24 h 再转 到 70 酒精中保存 制片前先将材料放入装有 1 mol LHCL 的小离心管中 置于 60 水浴锅中水浴 10 min 用拨针取根尖白色分生区部分 置于干净的玻璃载片上 滴一滴染色液 将材料捣碎盖上盖玻片进行镜检 在 OlympusBH 2 显微镜下观察 至少选取 10 个以上的细胞统计染色体数目 并进行拍照 2 2 3 相同基因型不同倍性大白菜性状的调查 将不同倍性组培苗转入 1 2MS 生根培养基 根长到 1 cm 左右转入营养钵炼苗 于 2013 年 1 月上旬移至温室育苗 3 月下旬定植于大棚 对植株长势进行调查并拍 照 同时选取 5 株 对各植株生殖生长时期叶片颜色 叶片形状 叶片大小 叶缘 和叶表面特征 花蕾大小 花瓣性状 形状 颜色 大小 雄蕊发育情况进行调查 相同基因型大白菜基于不同倍性水平的生物学性状及基因表达研究 9 2 3 结果与分析 2 3 1 二倍体 四倍体大白菜的获得 2 3 1 1 秋水仙素不同处理时间和浓度对大白菜染色体加倍的影响 利用秋水仙素处理大白菜 85 1 单倍体组培苗诱导染色体加倍 表 2 1 以质量 浓度 0 2 秋水仙素溶液处理 72 h 得到二倍体的诱导率最高 其诱导率为 14 81 但处理后植株长势较弱 分蘖能力较差 浓度 0 2 秋水仙素处理 48 h 得到二倍体的 诱导率为 13 72 且处理后植株长势良好 选用此浓度和处理时间对单倍体组培苗 进行两次处理用于合成大白菜四倍体 表 2 1 秋水仙素处理单倍体大白菜诱导染色体加倍效果 Table 2 1 Effect of colchicine treatments on induction of haploid Chinese cabbage 诱导的植株数 Number of plants induced 处理 Treating 处理的单倍体植株总数 Number of haploid plants treated 单倍体 Haploid 二倍体 Diploid 四倍体 Tetraploi d 嵌合体 Chimera 0 1 48h2150016 0 1 72h2941024 0 2 48h5157039 0 2 72h2704023 0 2 48h 0 2 48h4322635 2 3 1 2 不同基因型单倍体植株诱导的差异 用质量浓度为 0 2 秋水仙素对 5 个单倍体大白菜组培苗处理 48 h 其二倍体诱 导率和嵌合体率均有不同 上述 5 个单倍体均是由二倍体大白菜 85 1 EMS 诱变处 理后 通过游离小孢子技术获得的 其中 11 9 二倍体诱导率最高 20 00 而 13 11 二倍体诱导率为 0 其他三个诱导率比较接近 在 14 17 左右 13 1 嵌合体诱导 率最高达到 82 86 其他 4 个植株的嵌合体诱导率在 60 70 左右 13 11 秋水仙 素处理过后仍有单倍体植株 表 2 2 不同基因型单倍体大白菜秋水仙素诱导率的差异 Table 2 2 Different induction of haploid Chinese cabbage with different genotype 单倍体植株 Haploid plant 处理总数 Treatment number 处理后二倍体数 Diploid number after processing 处理后嵌合体数 Chimeric number after processing 处理后单倍体数 Haploid number after processing 诱导率 Inductivity 嵌合率 Chimeric percentage 11 1614016 67 66 67 11 9513020 00 60 00 11 25715014 28 71 42 河北农业大学硕士学位 毕业 论文 10 13 123419017 39 82 26 13 1112084066 67 2 3 2 相同基因型大白菜二倍体 四倍体杂交 取授粉后 6 d 8 d 10 d 的子房于改良 White 培养基上培养 24 d 从该培养基 上培养的子房中获得了成活的胚珠 2 个 图 2 1 A C 将成活的胚珠转接于 1 2MS 培养 30 d 后得到再生植株 1 株 图 2 1 E F 图 2 1 胚挽救过程 Fig 2 1 Embryo rescue techniques A 成活子房 B 未成活子房 C 成活胚珠 D 未成活胚珠 E 再生植株 F 组培苗 A Survival of the ovary B Death of the ovary C Survival of the ovule D Death of the ovule E Regenerationplant F Tissue culture seedling 2 3 3 倍性鉴定 2 3 3 1 保卫细胞大小的观察 通过叶片保卫细胞大小的观察 对秋水仙素处理后的植株进行初步筛选 保卫 细胞大小大致分为 3 类 单倍体植株保卫细胞大小为 11 23 8 04 m 图 2 2 A 其余两类植株的叶片保卫细胞大小分别为 20 05 14 53 m 34 58 22 56 m 图 2 2 B C 将其分别作为二 四倍体的进一步鉴定对象 二倍体与四倍体杂交获得 的植株其保卫细胞大小为 25 26 18 35 m 图 2 2 D ABC DEF 20 m20 m20 m 20 m 相同基因型大白菜基于不同倍性水平的生物学性状及基因表达研究 11 图 2 2 不同倍性植株气孔大小的差异 Fig 2 2 The stomatal size discrepancy of plants with different ploidy A 单倍体 B 二倍体 C 四倍体 D 再生植株 A haploid B diploid C tetraploid D Regeneration plant 2 3 3 2 DNA 流式细胞仪倍性鉴定 对初步筛选出来的植株进行 DNA 流式细胞仪鉴定 获得了一套来自同一单倍 体植株的二倍体 四倍体大白菜 流式细胞仪倍性检测结果 单倍体的分离峰出现 在荧光强度为 25 处 图 2 3 A 二倍体分离峰出现在荧光强度为 50 处 图 2 3 B 四倍体分离峰出现在荧光强度 100 处 图 2 3 C 即二倍体植株细胞的 DNA 含量是单倍体的 2 倍 四倍体植株细胞的 DNA 含量是单倍体的 4 倍 进一步 确认了气孔大小鉴定倍性的结果 二倍体与四倍体杂交获得的植株分离峰出现在荧 光强度接近 60 处 图 2 3 D 非三倍体植株 图 2 3 不同倍性植株的 DNA 含量峰值 C D A B ABC D 河北农业大学硕士学位 毕业 论文 12 Fig 2 3 DNA content of plants with different ploidy A 单倍体 B 二倍体 C 四倍体 D 再生植株 A haploid B diploid C tetraploid D Regeneration plant 通过对 0 2 秋水仙素处理 48 h 的大白菜组培苗的鉴定 共得到二倍体大白菜 14 棵 四倍体大白菜 6 棵 其中包括一组来自同一单倍体的二倍体和四倍体大白菜 即获得了相同纯合基因型的单倍体 二倍体和四倍体大白菜 该组不同倍性材料进 一步用于特性观测和基因表达分析 2 3 3 3 根尖染色体数目