蛋白质的提取纯化和分析

蛋白质的提取纯化和分析 材料选择和预处理 细胞破碎 蛋白质的粗提 目录 题目分析 蛋白质的纯化 分析检测 题目解析 已知某蛋白的分子量约为17kDa 等电点3 9 4 1 它能耐一定的高温 在90 C加热3 4min后仍然能够保持80 的活性 该蛋白含有较多的疏水性残基 与Ca2 结合后可以暴露它的疏水基团 该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂 在钙离子的作用下才能起到暴露疏水集团发挥性能 结合蛋白质基础知识从而可以判断其为钙调蛋白 TEXT 成年健康雄性大鼠脑组织20克 比雌鼠体积大 成本较低物种易获得 将切取的组织用4 预冷0 01mol l的PBS漂洗去血渍 再用滤纸吸干残留的PBS 磷酸盐缓冲液 预处理过的组织 细胞破碎 高速珠磨法 制备组织细胞悬液 剪碎法 蛋白质被释放出来 破碎 剪碎法 1 将组织块放入平皿后 加入少量PBS 2 用眼科剪将组织剪至匀浆状 加入10mlPBS 3 用吸管吸取组织匀浆 用200目尼龙网过滤到试管内 返回 高速珠磨法 破碎机理 高速珠磨法是一种有效的细胞破碎方法 珠磨机是该法所用的设备 其结构示意图见图 1 微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合 珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切 碰撞促进细胞膜破裂 释出内含物 在珠液分离器的协助下 珠子被滞留在破碎室内 浆液流出 从而实现连续操作 破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走 钙调蛋白的粗提取 抽提蛋白质破碎后 使用适当的溶剂 将蛋白质提取溶解到溶剂当中 常用稀酸 稀碱 有机溶剂 等电点3 9 4 1 酸性蛋白质 稀碱性溶液抽提 溶液碱性的程度 碱性过大则难以复性 pH调至等电点偏碱的一侧 4 1 粗提取物 离心操作 除去固体杂质的上清液 热变性初步纯化 天然结构 钙调蛋白 一般蛋白 100 热稳定性不同 其他方法 盐析法 等电点法 有机溶剂法 蛋白质的精纯和分析鉴定 亲和色谱 配体 蛋白质 蛋白质和配体复合物 洗脱 结合 耦联 作用机理 金属螯合亲和层析 钙调蛋白的外形似哑铃 有两个球形的末端 中间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连 每个末端有两个Ca2 结构域 每个结构域可以结合一Ca2 这样 一个钙调蛋白可以结合4个Ca2 钙调蛋白与Ca2 结合后的构型相当稳定 金属螯合色谱 原理 利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用 结合在固定相上 二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸 组氨酸 咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离 步骤 1 制作金属螯合亲和色谱柱 用浓度为0 2mol L的CaCl2溶液上柱 将上清液PH调制6 8 加入蛋白质解离抑制剂 慢上样3 再用配体CaCl2溶液洗脱 下方流出为目的蛋白液 用大使管或者烧杯盛装之 2 上柱后依次用50mlbufferB 200ml含0 5mol LNaCl的bufferB洗脱 下方用大试管或烧杯收集杂质液 配体 蛋白质 蛋白质和配体复合物 步骤 目的 除去蛋白液中配体离子 凝胶过滤色谱的洗脱 分析鉴定 定性分析 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 测定蛋白质分子量 用SDS PAGE检测不同纯化阶段所获得的提取液样品中CaM的纯度与相对分子质量 电泳采用质量分数为15 的分离胶和质量分数为5 的浓缩胶 120V电压条件下进行电泳 直至溴酚蓝达到凝胶底部 考马斯亮蓝染色 凝胶成像仪成像 当分子量在15KD到200KD之间时 蛋白质的移率和分子量的对数呈线性关系 符合下式 logMW K bX若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图 可获得一条标准曲线 未知蛋白质在相同条件下进行电泳 在相同条件下进行电泳 根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量 定量分析 go