第四章-蛋白质分析

第四章 蛋白质(Protein)分析 第一节 基础知识一概述1. 蛋白质 “protein” 由希腊文转 “最原始的”蛋白质： 主要由20多种氨基酸以肽键（peptide bond）连接而成的（肽链chain）具有确定构像的生物大分子， 此外许多蛋白质还会有一些非氨基酸成份，如糖、脂、核苷酸、磷酸、金属离子等。 辅基（成键），配基（分子间力）2 性质：l 分子量从数千数百万l 是生物体重要组成部分，重量上占细胞干重的一半以上，肌肉、皮肤、血液、毛发重要成份l 功能上参与几乎所有的生命活动过程， 酶、运输蛋白、防御蛋白、激素蛋白、毒蛋白、受体运动蛋白、结构蛋白l 种类 估计1010-1012种二结构蛋白质结构异常复杂，分为四级描述（一）一级结构（primary structure） 指肽链中的氨基酸排列顺序（序列），也包括二硫键的定位。（蛋白质结构的基础）1肽键 peptide bond结构式 R1 H R1 O H NH2-C-COOH + NH2-C-COOH NH2-C-CNCCOOH H R2 H H R2 羧基 氨基 肽键 不同氨基酸首尾相接 一般肽键反式结构2 肽链 peptide chain由肽键连接而成多氨基酸链结构式 R1 O H O R3 NH2-CCNCCNCCOOH H H R2 H H N端残基 残基 C端残基 l 形成肽键后，氨基酸失水成为“氨基酸残基” residue “链中氨基酸单元”l 结构式习惯写法 N端在左 C端在右3 多肽 （polypeptide）2个氨基酸残基 肽链 二肽3个氨基酸残基 肽链 三肽1012氨基酸残基 肽链 多肽数十氨基酸残基 肽链 蛋白质 蛋白质多肽4 二硫键 disulphide bond 形成 NH2 H-C-CH2SH COOH半胱氨酸 Cysteine (Cys)分子中两SH在碱性pH下，易氧化成硫硫键（二硫键）结构图SH + SH + O2 SS + H2O 种类链内二硫键 同一肽链内Cys间链间二硫键 不同肽链内Cys间5.蛋白质一级结构牛胰岛素肽链结构图1953年，英国Sanger测序 5700MW中国 6年9个月 1965年首先合成结晶胰岛素(二） 二级结构 （Secondary structure）一级结构线性链式结构氨基酸链经过一定程度盘绕和折叠，形成二级结构常见的有： 螺旋、折叠、转角 无规则卷曲 最常见最简单完全伸展结构螺旋 helical form (链内氢键) 某残基中NH与另一残基C=O 形成氢键折叠 片结构（pleated sheet structure）由链间氢键形成并列肽链结构（逆向平行，顺向平行）形成两条，多条 顺、逆向平行结构一条肽链回折 逆向平行（三） 三级结构（tertiary structure） 蛋白质在二级结构基础上，分子进一步盘绕、折叠，形成三级结构，使分子形成一定外形。 如形成1.球蛋白 globular protein 酶，抗体 内部疏水性，外部亲水作用力：链间二硫键，或分子间力 疏水作用力2纤维蛋白 fibrous protein线性肽链联接成片，束 分子间二硫键 螺旋 弹性蛋白 分子间力折叠 弹性较差三级结构是蛋白质功能和活性的结构基础如酶、抗体的活性中心（四）四级结构 （quaternary structure） 1. 可以认为一些具有特定三级结构肽链（亚基）通过非化学键形成的大分子体系 多链空间布局 2每个具有三级结构的肽链单元亚基，多无活性 3结合蛋白结合一些非蛋白组分辅基配基 4.也有蛋白仅有一个肽链，结构仅到三级结构为止（四） 结构性质 1一级结构（化学键）是基础 高级结构取决于一级结构？ 不同一级结构，高级结构不同； 同一级结构，高级结构同？2 二、三、四高级结构 决定外形，内部结构， 蛋白活性，功能，直接关系，一级结构 共价键3 蛋白质高级结构，具有稳定性，可变性 稳定性非共价键分子间作用力，氢键，离子键。 疏水性，范德华力等，1/90 共价键 可变性活性改变， 化学反应 易变性：热，紫外线，酸碱，表面活 性剂，重金属，有机溶剂，剧烈搅拌物理变化三性质1. 两性电解质 R1 O H O R3 NH2-CCNCCNCCOOH H H R2 H H N端残基 残基 C端残基 酸碱活性基团：亚胺基pH=0-14 无明显酸碱性质N端残基 -NH2C端残基 -COOHR1、R2、R3COOH:谷氨酸 -CH2CH2COOH Glu 天冬氨酸-CH2COOH AspR1、R2、R3NH2: 赖氨酸 -CH2CH2CH2CH2NH2(Lys) 精氨酸-CH2CH2CH2C(NH)NH2 (Arg) 组氨酸(His) -CH2-C=CH NH N CH等电点pI在某pH，蛋白分子表观电荷为0，不同蛋白质，等电点不同，蛋白分离的重要依据2.大分子性质 分子量 数千数百万， 达千万分子大小，如3.4万MW球状4.3nm，胶体1-100nm，蛋白质亲水基在外，带电荷，亲水胶体，表面水化层与电荷使其不致凝集 性质l 扩散速度慢，可以用离心分离l 粘度大l 不能透过半透膜，可利用渗析分离3.变性蛋白质空间构象（二、三、四级结构）破坏 不发生肽链的断裂 理、化、生性质改变变性 分类： 可逆变性 不可逆变性 影响变性的因素l 紫外线l 加热，变性，凝固，如煮鸡蛋l 电解质，强酸，牛奶凝结，三氯乙酸，血浆蛋白沉淀强碱，盐：NaCl (NH4)2SO4 Na2SO4 盐析沉淀 如豆腐， 用于血浆蛋白分离， 通常不变性， 重金属盐：Hg Pb Cu Ag 通常变性 解毒l 有机溶剂：酒精，甲醇，丙酮， 沉淀、变性 如：酒精消毒 变性， 沉淀， 凝固l 变性不一定沉淀或凝固l 沉淀不一定变性l 凝固肯定变性，沉淀第二节 定量分析方法 定量前，经过一定的分离净化，纯化蛋白过程一光谱法 见P387（一）紫外吸收光谱法1. 原理：AAs中含芳环：CH2 苯丙氨酸 Phenylalanine (Phe)CH2 色氨酸 Tryptophan(Typ,Trp)NH-CH2- -OH 酪氨酸 Tyrosine (Tyr)苯丙氨酸，lmax257nm酪氨酸，lmax280nm色氨酸，lmax280nm 有苯环分子结构 280nm附近有吸收末端吸收220nm肽键，但有很多物质在此有吸收蛋白质通常在280nm有最大吸收峰， 核酸有干扰260nm 2. 方法：（1）标准对照法，需标准品（2）吸收系数法，粗测法，1cm比色池 A2801 C=1mg/ml，不同蛋白 C=1mg/ml A2800.7-2.4 C(mg/ml)=1.45A280-0.74A260C(mg/ml)=1.55A280-0.76A2603. 特点：粗测定量，不同蛋白phe tyr trp 含量不同，有标准品较准，抗干扰能力弱对蛋白无破坏，常用于柱色谱中洗脱峰的测定（二）荧光光谱法苯丙氨酸，lex257nm lem280nm 强度弱酪氨酸， lex280nm lem303nm 强度强色氨酸， lex280nm lem348nm 强度强蛋白质 lex280nm lem340-350nm二化学法1.凯氏定氮法（kjeldehl method）测有机物含氮量经典方法 原理：蛋白质中含氮量14-16，见书表 P388 方法： 消化：蛋白质+浓H2SO4(NH4)2SO4 几个小时蒸馏：(NH4)2SO4+NaOHNH3硼酸标准溶液吸收 水蒸气蒸馏滴定：酸碱滴定 特点： 操作繁琐，测定较准确，常量分析 总氮含量，干扰核酸、脂类、生物碱、卟啉2.双缩脲法（Biuret method） 名不附实？ 原理：P390蛋白质肽键CO-NH-，在碱性溶液中Cu2+络合蓝色产物 545nm测，蛋白+试剂30min 特点：不同蛋白差异小，可靠。灵敏度低，1mg/ml4. 福林酚法（Lowry method）原理： 蛋白酮复合物Folin 试剂（磷钼酸磷钨酸盐），钼兰和钨兰复合物（深蓝） 750nm测A 600nm（800nm）有吸收 750nm酪氯酸 色氨酸有一定贡献机理尚未全清 特点：使用众多，灵敏度高，20g/ml5. 染料结合方法应用最为广泛，利用染料与蛋白质结合。染料种类：甲基橙、考马斯亮兰、溴甲酚绿等常用：（Coomassie brilliant blue，CBB考马斯亮兰G250）P394电泳染色方法，染料与蛋白结合，最大吸收波长改变，吸光度增大：464595nm 快速（2-5分钟），灵敏（5g/ml），常用三免疫法已讲过第三节 蛋白质分离方法以上介绍，测总量蛋白方法，未有分离，如测单一结构蛋白，必须分离一电泳分离1支持介质 分类：纸，醋酸纤维素膜 淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺，凝胶（常用）， 孔大， 最常用 聚丙烯酰胺，凝胶（Polyacrylamide gel）PAGE，丙稀酰胺（剧毒）+甲叉双丙稀酰胺共聚合凝胶 激发 多孔网状 四甲基乙二胺 过硫酸铵，孔径大小聚合条件，单体浓度决定孔径大小分子筛效应（molecular sieving effect） 分子量（大小）有关，分子小 走的快2电泳装置圆盘（柱），垂直 水平（用的最多）3.常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 原理：（1） 蛋白质侧链谷天，赖组精，不同PH ，不同电荷，不同蛋白质， 同一pH 带电荷不同，等电点不同（电荷不同） 分子量不同，分子大小不同（分子量不同）常规聚丙烯酰胺凝胶电泳分离原理：电泳效应：电荷大小差异分子筛效应：分子大小差异 质荷比（2） 特点：样品电泳后不变性（3） 关键：l 缓冲液选择:pH 8.0-9.5 离子强度10-100mM/Ll 凝胶选择：孔径，梯度方法：制胶电泳 1-2-4小时检测：染色（考马斯亮兰）脱色，扫描，照相，转移4 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（十二烷基硫酸钠 SDS-PAGE） 原理：在样品介质和聚丙烯酰胺PAG加入表面活性剂SDS 强还原剂硫酸乙醇SDS变性剂，断裂氢键，破坏蛋白 二、三级结构，还原剂二硫键断裂 蛋白质蛋白质亚基SDS胶束复合物 长椭圆棒形结构SDS带负电荷，大大超过原蛋白所带电荷，消除了不同蛋白电荷差异SDS-PAGE，蛋白质迁移率（保留时间）决定于蛋白质亚基的分子量大小，按分子大小差异进行分离 方法：l 蛋白：SDS1：4-1：3 重量比l 离子强度10-100mmol/L5.等电聚焦（isoelectrofocusing）IEF 当前一维电泳中具有最高分辨率的技术原理：利用蛋白质等电点不同，在一个稳定、连续、线性pH 梯度中进行蛋白质分离，载体两性电解质（溶液）pH 梯度固相PH梯度，+pH3.5 5.0 6.5 8.0 9.5-+-+-+_+ -+_ 6. 双向电泳（2-D）-分辨率最高，最高一万点（2万-5万）信息最多，第一向等电聚焦， 第二向梯度SDS电泳 分子量7. 毛细管电泳区带，吸附。等电聚焦，凝胶二免疫学方法 抗原抗体1.免疫印迹2.免疫电泳3.免疫亲和色谱 immunoaffinity chromatograpy 原理：固定相表面固定化特一抗体，样品上柱，待测抗原结合，待测抗原蛋白洗脱 +pH 2.5 洗脱剂三色谱分离方法 蛋白质分离 gel permeation chromatograly1.凝胶色谱，分子排阻色谱，固定相为凝胶2.反相液相色谱，分离多肽，蛋白5 亲脂色谱 Hgdrophobic interaction chromatography特殊反相色谱，不同C18，非极性 固定相用甲基、丁基、苯基、 固定相，非极性要多一些 流动相高盐度 12mol/l附：蛋白组学（Proteomics）介绍一蛋白组1994年，澳大利亚悉尼 Macquarie大学，Marc Wilkins, Keith Williams 1994年 提出Wasinger 1995年第一次在出版物中使用。 proteome proteomics 蛋白组 蛋白组学 genome genomics 基因组 基因组学蛋白组学定义：“一种基因组的全部蛋白” “由基因组编码的一整套蛋白质” 不够准确？在人类基因组计划后（后基因组时代） 发展趋势：从结构功能研究=基因RNA蛋白质功能蛋白质 基因理论设计，计算表达全部蛋白质及 活动方式（高级结构）= 基因组：基因序列数据 DNA 人5-10万 基因表达数据RNA 蛋白组：基因产物数据蛋白质 25-50万 蛋白功能数据蛋白功能：详尽直接分析基因组编码的蛋白质的表达、定位（组织、细胞、亚细胞器）、结构。基因组信息不能充分预测蛋白的结构和动力学= 蛋白组研究特定条件下细胞，生物体，体液内蛋白定量表达情况。= 蛋白组对基因组编码的所有蛋白质的鉴定 对不同转录条件下的蛋白质表达变化的复 杂分析（一个蛋白质可能有400个化学修 饰来完成其功能）=蛋白组学生物样本中蛋白的系统分析与存档。=蛋白组学目的：归类细胞中的蛋白的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系和功能。=绝大多数生物调控过程、疾病的原发过程、大多数药物靶标均是发生于蛋白水平。= 蛋白组分析一种基因组或一个细胞或组织类型所有蛋白的表达。由于同一时间特定的细胞、组织或有机体中并非所有的蛋白都表达，因此蛋白质组是动态的。二蛋白组研究过程1 合理设计多学科交叉2 试样制备试样鉴定3 二维凝胶电泳蛋白质分离技术、图象分析4 酶裂解， 多肽质量指纹谱蛋白鉴定 序列分析结构分析5 数据解释生物信息学 bioinformatics 分析1 合理设计蛋白源，选什么，活体细胞培养8. 试样制备蛋白提取避免任何定量定性的变化 严格控制，尽量保持本来状态 不被生物体酶分解9. 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳一维，等电聚焦，二维SDSPAGE，目前最高分辨率，数千点，目前是唯一的一种很费时，费力，重现性不好。图象分析，电泳图可视化，计算机对比已