丙泊酚对肥厚心肌Ca2+-ATPase.doc

一、立论依据 （包括研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述本课题的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。（一）研究意义：心脏的基本功能是将血液泵送到周围组织。过去，评价心脏功能多注重心脏的收缩功能，近年，心脏的舒张功能异常逐渐受到重视。在美国，有心力衰竭患者500万例，每年新发病例50万例，其中有一半患者心力衰竭的主要原因是舒张功能不全，但左心室射血分数（LVEF）仍然正常1,2。大多数心脏疾病患者的心脏舒张功能异常早于收缩功能异常3。而影响左室舒张功能最主要的决定性因素是左室的松弛性和顺应性。在几乎所有类型的心脏疾病中，舒张充盈异常是心肌松弛变慢或受损，典型的心脏病变包括左心室肥厚、心肌缺血、梗死或肥厚型心肌病等4。心肌肥厚是心血管疾病的一种独立危险因素5，心肌肥厚是心肌细胞及其间质细胞对诸多因素（如炎性细胞因子，神经体液因素及免疫因素等）的一种应答反应，是细胞内一系列基因异常表达的结果，主要表现为心肌细胞肥大、胶原增生、重量增加。在无明显疾病的情况下，心脏亦随年龄的增长呈退行性改变，解剖学的主要改变是心室壁肥厚、心肌纤维化加重以及瓣膜的纤维钙化6。最近的研究多利用非负荷性指标评价左心室的舒张功能，研究表明即使没有心血管疾病，男性和女性左心室松弛的速度也都会随年龄增加而降低7。为了克服后负荷阻力，肥厚的心肌收缩力增强，使心排血量在相当长时间内能够维持在正常水平，不表现出心力衰竭的症状。然而，心肌肥厚者心肌顺应性差，舒张功能降低，心室舒张末压升高，客观上已经出现心力衰竭表现。Ca2+在心肌兴奋收缩耦联中发挥了极为重要的中介作用。心脏正常舒张的前提是胞浆中的Ca2+浓度要迅速降至“舒张阈值”，即从10-5mmol/L降至10-7mmol/L，这样Ca2+才能与肌钙蛋白脱离，肌钙蛋白恢复原来的构型、肌节延长、心脏舒张。在人类，大约75%的细胞内钙离子被肌浆网中的钙-ATP酶（Ca2+-ATPase）移至肌浆网，25%由钠-钙交换体流出细胞外8。因此，在钙循环过程中，Ca2+-ATPase 起着重要作用，它的活性和功能直接影响心肌的舒缩功能9 。Ca2+-ATPase的表达水平降低导致心功能不全（压力过负荷所致）、加速了心力衰竭的进展10。因而，Ca2+-ATPase浓度降低和肌浆网对钙离子摄取的相应减少会影响舒张功能。尽管收缩功能正常，钙离子重摄取的易损性是心脏疾病早期左心室松弛异常的原因。丙泊酚是一种新型的快效、短效静脉麻醉药，具有苏醒迅速而彻底、持续输注后无蓄积等特点，是临床麻醉和诱导的常用药物，但对循环有明显的影响。以往研究表明，全麻药对心肌的抑制作用与细胞内钙离子浓度的变化密切相关11，通过降低心肌细胞内Ca2+浓度，使心肌在收缩过程中得不到足够的Ca2+，其途径包括抑制肌浆网对Ca2+的再摄取，使肌浆网内Ca2+储存量减少。而丙泊酚对心肌肥厚心脏Ca2+-ATPase活性影响的研究则相对较少。（二）国内外研究现状分析：1、丙泊酚对正常心脏血流动力学及Ca2+-ATPase活性的影响丙泊酚全麻诱导时可引起血压下降、心率增快。其降低血压机制系使外周血管阻力下降、心肌抑制、心输出量减少以及抑制压力感受器对低血压的反应，心率轻度增快系对低血压的代偿反应，其对心脏的直接作用是心率减慢。在年老体弱、心功能不全患者血压下降尤其明显。丙泊酚可以产生两种不同的血流动力学影响：持续输注时的血管扩张和心脏前负荷的降低，以及再次快速静注丙泊酚后，产生早期的、持续时间较短的血管收缩作用，显著降低心室功能、增加外周阻力12。说明丙泊酚可能对功能障碍的心脏功能存在不利影响。心肌细胞内Ca2+浓度的调节主要通过心肌细胞肌浆网的释放与摄取，Ca2+-ATPase负责调控肌浆网对Ca2+的摄取。有研究表明13、14，丙泊酚呈浓度依赖地抑制心肌细胞膜上钙通道的开放，降低兴奋收缩偶联时细胞内钙离子的浓度，是其心肌抑制作用的原因之一，而对心肌细胞肌浆网释放Ca2+的功能则无明显影响。丙泊酚对正常心肌Ca2+-ATPase的活性也有影响。用不同浓度丙泊酚对离体的正常大鼠心脏功能和心肌Ca2+-ATPase的活性进行观察15，发现丙泊酚对心肌Ca2+-ATPase活性的影响呈双相性；低浓度(20mol/L)使Ca2+-ATPase的活性升高,而50mol/L时Ca2+-ATPase活性下降,说明Ca2+-ATPase活性可能是其抑制心肌舒张功能的原因之一。诸多研究表明，丙泊酚可以损害心脏的舒张功能16、17、18，丙泊酚影响心肌松弛的直接机制可能为：损害肌质网对钙离子的再摄取19及肌肉收缩的磷酸化调节20。2、丙泊酚对心肌肥厚心脏血流动力学及舒张功能的影响对自发性高血压大鼠血流动力学的研究表明，丙泊酚呈剂量依赖性的血管扩张，且较正常大鼠敏感，更易发生血管扩张21,用药后20min抑制达高峰，出现与剂量相关的血液及组织内血管紧张素的降低，由此推测，丙泊酚对血液动力学的抑制与肾素-血管紧张素系统（RAS）有关22。国内学者池萍等研究认为23，丙泊酚对高血压大鼠的心血管抑制作用大于正常血压大鼠，并指出其影响机制：在原有内皮因子失衡的基础上出现一氧化氮增加，内皮素减少，心功能进一步受到抑制。为观察丙泊酚对心肌肥厚心脏的影响，Ouattara等以兔为实验对象16，通过测量左心室舒张末期压力（LVEDP）,左心室收缩末期压力（LVESP）以及压力-容积关系等指标，比较丙泊酚对离体的正常心脏和心肌肥厚心脏的影响：丙泊酚在高浓度（300mol/L）时降低正常心脏和心肌肥厚心脏的心肌收缩和舒张功能，但是两组间没有显著差异，高浓度时引起心肌抑制的结果与Kanaya等人的报道一致24。 有学者将23例舒张功能障碍患者随机分为七氟醚和丙泊酚组25，通过超声心动图和血流动力学的观察，发现单独使用丙泊酚时，丙泊酚对存在舒张功能障碍患者的舒张功能没有不利的影响。这与大部分先前的动物和人类实验一致26、27、28。通过阅读文献及查新，了解到丙泊酚在高浓度时可降低心脏舒张功能，尚未见丙泊酚对肥厚心肌Ca2+-ATPase活性影响的报道。大鼠腹腔注射去甲肾上腺素（NE）后，主要发生左心室肥厚29,30。本实验采用腹腔注射NE建立心肌肥厚的动物模型，探讨丙泊酚对心肌肥厚大鼠血流动力学和心肌细胞质膜Ca2+-ATPase活性的影响。参考文献：1 Senni M, Rodeheffer R, Tribouilloy C,et al. Use of echocardiography in the management of congestive heart failure in the community. Journal of the American College of Cardiology, 1999;33(1):164-170.2 Zile M, Brutsert D. New concepts in diastolic dysfunction and diastolic heart failure: Part I:Diagnosis, prognosis, and measurements of diastolic function. Circulation, 2002;105(11):1387-1393.3 Vasan RS，Benjamin EJ，Levy D. Congestive heart failure with normal left ventricularsystolic function. Clinical approaches to the diagnosis and treatment of diastolic heart failure .Archives of Internal Medicine,1996; 156(2):146-157.4 方理刚，朱文玲主译.超声心动图手册(原书第三版).北京：科学出版社，2009:152.5Lips DJ,dewindt Lt,van Kraaij DJ,et al. Molecular determinants of myocardial hypertrophy and failure: alternative pathways for beneficial and maladaptive hypertrophy. Eur Heart J. 2003;24(10)883-896.6 庄心良,曾因明,陈伯銮,主编.现代麻醉学M.第三版. 北京:人民卫生出版社，2010:1444.7 Redfield M, Jacobsen S,Bourlag B,et al.Age-and gender-related ventricular-vascular stiffening: a community based study. Circulation ，2005;112(15):2254-2262.8 Hasenfuss G. Calcium pump overexpression and myocardial function:Implications for gene therapy of myocardial failure.Circulation Research,1998;83(9):966-968.9 Inesi G,Prasad AM,Pilankatta R,The Ca2+ ATPase of cardiac sarcoplasmic reticulum: physiological role and relevance to diseases.Biochem Biophys Res Commun，2008; 369(1):182-187 .10 Chen L,Hahn H,Wu G,et al.Opposing cardioprotective actions and parallel hypertrophic effects of delta PKC and epsilon PKC.Proc Natl Acad Sci USA，2001;98(20):11114-11119.11. 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Anesthesiology，1998; 88(1): 180189.19 Sprung J, Ogletree-Hughes ML, McConnell BK, et al. The effects of propofol on the contractility of failing and nonfailing human heart muscles. Anesth Analg，2001; 93(3): 550559.20 Kanaya N, Gable B, Murray PA, et al. Propofol increases phosphorylation of troponin I and myosin light chain 2 via protein kinase C activation in cardiomyocytes. Anesthesiology，2003; 98(6):13631371.21 Boilot A, laurant P, Berthelot A, et al. Effects of propofol on vasecular reactivity in isolated aortae from normotensive and spontaneously hypertensive rats. Br J Anaesth, 1999,83(4):622-629.22 蔡宏达，林财珠，林健清.丙泊酚对高龄高血压大鼠血液动力学肾素-血管紧张素系统的影响.临床麻醉学杂志,2003;19(10):616-618.23 池萍，林财珠，杨锡馨.异丙酚对自发性高血压大鼠血压和血浆及心肌中内皮因子水平的影响.中华麻醉学杂志，2002；22（10）：622-623.24 Kanaya N, Murray PA, Damron DS. Propofol and ketamine only inhibit intracellular Ca2+ transients and contraction in rat ventricular myocytes at supraclinical concentrations. Anesthesiology, 1998;88(3):781791. 25 Filipovic M，Michaux I,Wang J,et al.Effects of sevoflurane and propofol on left ventricular diastolic function in patients with pre-existing diastolicdysfunction.Br J Anaesth,2007;98 (1): 1218. 26 Graham MR, Thiessen DB, Mutch WA. Left ventricular systolic and diastolic function is unaltered during propofol infusion in newborn swine. Anesth Analg，1998; 86(4): 717723.27 Pagel PS, Schmeling WT, Kampine JP, et al. Alteration of canine left ventricular diastolic function by intravenous anesthetics in vivo. Ketamine and propofol. Anesthesiology，1992; 76(3):419425.28 Gare M, Parail A, Milosavljevic D, et al. Conscious sedation with midazolam or propofol does not alter left ventricular diastolic performance in patients with preexisting diastolic dysfunction: a transmitral and tissue Doppler transthoracic echocardiography study. Anesth Analg，2001; 93(4):865871.29Barth W, Deten A, Bauer M,et al. Differential remodeling of the left and right heart after norepinephrine treatment in Rats: Studies on cytokines and collagen. J Mol Cell Cardiol,2000;32(2):273-284.30 Bukhtiar H,Shah S, Kevin J, et al. Matrix metalloproteinases dependent EGF receptor activation in hypertension and left ventricular hypertrophy. Trend Endocrinol Met,2004;15(6):241-243.31 Tsoporis JN, Marks A, Kahn HJ, et al. Inhibition of norepinephrine-induced cardiac hypertrophy in s100beta transgenic mice. J Clin Invest,1998;102(8):1609-1616.二、研究方案（一）、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题1、研究目标旨在观察丙泊酚对心肌肥厚大鼠血流动力学、细胞质膜Ca2+-ATPase活性及Ca2+浓度的影响，拟探讨丙泊酚与心肌肥厚大鼠Ca2+-ATPase活性的关系。2、研究内容通过腹腔注射NE制备心肌肥厚大鼠模型，持续泵入不同剂量丙泊酚，测量不同时间点大鼠SBP、DBP、MAP和HR的变化，应用分光光度法测量细胞质膜Ca2+-ATPase活性和Ca2+浓度，探讨丙泊酚对心肌肥厚大鼠血流动力学和细胞质膜Ca2+-ATPase活性的影响。3、拟解决的关键问题通过各项指标的测定，观察不同剂量丙泊酚对心肌肥厚大鼠Ca2+-ATPase活性的影响，通过Ca2+-ATPase活性的变化探讨丙泊酚对心肌肥厚心脏的影响。（二）、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析1、动物模型的制作 取体重230g260g雄性SD大鼠60只(宁夏医科大学动物实验中心提供)。随机分为五组: 对照组（A组，n=12），实验组（B、C、D、E组，各组均为12只）。心肌肥厚动物模型的建立：采用腹腔注射NE方法31，NE1.5mg/kg腹腔注射，Bid，连续15d得到心肌肥厚模型，期间自由进食，给水。给药期间密切观察大鼠体重、活动、进食、饮水及大小便等一般情况。假手术组：注射相同容量的生理盐水，连续15d。期间自由进食，给水。2、实验分组造模后第16日进行实验（实验前禁食12小时，自由饮水）。大鼠称重(BW)后，腹腔注射3%的戊巴比妥钠30mg/kg麻醉, 仰卧位固定于手术台。气管切开插管, 保留自主呼吸。分离一侧颈动脉置入24#套管针接监测仪, 针形电极插入皮下接监测仪，持续监测SBP、DBP、MAP和HR。分离股静脉置入24#套管针开放静脉，微量泵输入生理盐水4ml/h，稳定20min后开始实验。（1）对照组（A组，n=12）：A组：5mgkg-1（注入时间约15s）丙泊酚麻醉诱导后,静脉泵入丙泊酚30mgkg-1h-1持续30min；（2）实验组（n=48）分为4个亚组：B组（空白组n=12）：心肌肥厚模型制作完成，戊巴比妥钠麻醉后不做任何处理。C组（丙泊酚低剂量组n=12）：5mgkg-1（注入时间约15s）丙泊酚麻醉诱导后,静脉泵入丙泊酚30mgkg-1h-1持续30min；D组（丙泊酚高剂量组n=12）：5mgkg-1（注入时间约15s）丙泊酚麻醉诱导后,静脉泵入丙泊酚60mgkg-1h-1持续30min；E组（脂肪乳剂组n=12）：于15s内静脉注射1.2mlkg-1脂肪乳后，12mlkg-1h-1持续输注30min；四组持续输注的总容量相同（B组不处理）。3、观察指标 （1）、持续监测大鼠的生命体征（SBP、DBP、MAP和HR）：记录给药前（基础值），给药后1、3、5、10、15、20、25、30min的值。（2）、心脏重量参数的测定：实验完成后，深麻醉下断头处死大鼠，快速取下心脏,冰生理盐水冲洗,迅速剔除大血管，心外膜脂肪组织等，滤纸吸干血液，在电子天平上称取整个心脏重量（HW）；沿室间隔分离左右心室，称取左室及室间隔重量（LVW），右心室重量（RVW）,分别计算心重指数（HW/BW,mg/g），左心室重量指数（LVW/BW，mg/g）和右心室重量指数（RVW/BW，mg/g）。以HWBW，LVWBW作为判断心肌肥厚的指标。（3）心肌组织形态学观察：取左心室心尖部心肌组织大小约222mm，迅速放入甲醛液中固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色,光学显微镜观察心肌细胞及心肌间质的变化。（4）制备心肌组织匀浆：，称取约300 mg左心室心肌组织冰浴下制成10匀浆，4，3500 rmin，离心10min，取上清于-80保存，采用分光光度法进行心肌细胞质膜Ca2+-ATPase活性及Ca2+浓度的检测。4、实验设备 （1）电子天平 （2）BL-420生物机能实验系统（3）光学显微镜（4）匀浆机（5）低温高速离心机（6）分光光度仪5、 统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料以均数标准差表示，若正态分布且方差齐性，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)；两两比较采用SNK-q检验，若方差不齐则进行秩和检验。P0.05为差异有统计学意义。6、技术路线SD大鼠60只实验组 n=48对照组 n=12A组 n=12丙泊酚低剂量C组 n=12丙泊酚5mgkg-1诱导，30mgkg-1h-1持续泵注戊巴比妥钠麻醉后不做任何处理丙泊酚5mgkg-1诱导，30mgkg-1h-1持续泵注丙泊酚高剂量组D组 n=12丙泊酚5mgkg-1诱导，60mgkg-1h-1持续泵注空白组B组 n=12脂肪乳12mlkg-1h-1持续输注30min脂肪乳剂组E组 n=12实验二： 各组心脏重量参数测定,心肌形态学观察及酶、Ca2+的检测： 心脏重量参数的测定； 心肌组织形态学观察； 制作大鼠心肌匀浆，进行心肌细胞质膜Ca2+-ATPase活性及Ca2+浓度的检测。实验一：观察对A、C、D三组血流动力学影响：观察给药前（基础值），给药后1、3、5、10、15、3