四君子汤对D-半乳糖致衰老模型大鼠抗衰老作用的实验研究.doc

四君子汤对D-半乳糖致衰老模型大鼠抗衰老作用的实验研究 学学位论文 暨南大四君子汤对 D- 型大鼠抗衰老作用 的实验研究 半乳糖致衰老模目录 中 文摘要? 1英 文摘要? 3主要英文 缩略词表? 5前言 61 中医学 对 衰老的 认识 5 2 现代医 学 对衰老 的认识9实验 研究? 171 大 鼠 衰老模 型 的制备 及四 君子 汤对其 行 为学影响17 1.1 材料17 1.2 分组 造模及给药17 1.3 水迷 宫实验? 18 2 四君子 汤对 D- 半乳 糖 致衰老大 鼠自由基 的影响? 19 2.1 材料18 2.2 组织 匀浆的制备19 3 四君子汤对 D- 半乳糖致衰老模型大鼠脑 mtDNA 的影响? 20 3.1 材料21 3.2 线粒体 DNA 的提取及 定量22 3.3 PCR 反应? 23 实验 结果 25 1 行为学观察结果 25 2 自由基观察结果 26 3 PCR 观 察 结果29 讨论? 31 结论? 40 参考文献41 致谢? 480学学位论文 暨南大四君子汤对 D- 型大鼠抗衰老作用 的实验研究 半乳糖致衰老模中文摘要 目的 : D-、脑海马 组中由线粒体 脑织自基 DNA 等?方法 : 60 健雄 只康性 D S 分为随机 大, 鼠 5 余 , 组外对照空白正常除 , 组 4 组鼠 大生 维素 右 、 E 、 后别四子胃 然分以君汤灌, D , -中 SOD 、 MDA 、 NO , NOS 等有关自由基指标以及对脑 mtDNA?结果 : 1 对 ( 1 , 况和体重:造模前各组动物反应良好 )一般情模组大鼠腹腔注射造 动捷 行敏。 食正常,饮 发滑 毛光, D- 半乳糖后 1)对水迷宫时间的影响:四君子组、维生素2 ( E 组和空白组与单纯模型组比较P0.01 ) ,素 E ( 组与单纯模型组比较有统计学差异 P0.05 ) 归饮组与单纯模型组比较 右 ,( P0.05 ) ; ( 3 生 维素 : ) E 组与单纯模( P0.01 ) 归组 右饮、 ,P0.05 说明四君子汤、维生素 ,此结果 E 可改善衰老模型大鼠的空间记忆能2 ( 较 1 SOD 、 影 的素 E ( 组与单纯模型组比较有统计学差异 P0.01 ) 君子组与单纯模型组比较 四 ,P0.05 ) SOD E中 SOD 四君子汤的作用不明显; 而 平 , 水 ( 2 MDA1的影 )对 高衰老模型大鼠脑组织可提 有增高趋势,此结果说明右归饮、维生素 ,但 无统计学意义(维生响: 右归饮组 )对 对自由基作用的比 力, 而右归饮作用不显著;意义四君子组与单纯模型组比较无统计学 型组比较有统计学差异对水迷 宫游泳错误次数的影响 无统计学差异维生有统计学差异,其中四君子组和空白组与单纯模型组比较有显著性差异(解;尾部出现色素斑点沉着并逐渐加重,嗜睡。给药后,异常的行为均有不同程度的缓体重开始减轻,行动缓慢,反应迟钝,毛发干枯发黄、缺乏光泽,双颊脱毛明显,月余部分大鼠行为学指标的影响响。易缺失区的影 组织观察其对衰老模型大鼠水迷宫游泳到达出口的时间及错误次数、对衰老模型大鼠脑半乳糖致衰老动物模型 腹腔注射 归饮并为开发研制出抗衰老新药奠定基础。 而进一步拓展四君子汤的临床使用范围,求中医学脾肾相关理论的物质基础;从基因水平揭示四君子汤延缓衰老的机制,从的影响,论证健脾补肾抗衰老的机理,探半乳糖致亚急性衰老模型大鼠学习记忆能力、 观察四 君子汤、右归饮对学学位论文 暨南大四君子汤对 D- 型大鼠抗衰老作用 的实验研究 半乳糖致衰老模生素维 、 右归饮组 : 响 E ( 义 P0.01 ) 子与组君( 义 P0.05 ) 素 果 饮 此、 结 , E 可降低衰老MDA ( 3 NO 的( 异 P0.01 ) ,中 NO , 维生素 E 组与单纯模型组比较无统计学差异 ( P0.05 ) ,但 NO ( 4 NOS( P0.01 ) NOS 水,归 平右E ( 组与单纯模型组比较无统计学差异 P0.05 ) NOS ; 势 3 对脑 mtDNA E 有防御模型大鼠脑 mtDNA 结论 : 1 四君子汤可改善 D-记忆 的功能 。 2 右归饮能 减轻模型大 鼠脑组织自 由基 对 机 体 的 损 伤, 具有良 好 的。 3 DNA ,调 、作用 有关,可为 进一 步 研 究 四 君 子 汤抗 衰老 作 用 的分子 机 制 奠定 基础 。 4 脾肾相关键词 :四君汤子 饮 衰老模 型 D- 糖素 E基学 体 DNA2线粒行为 自由 维生 半乳 右归触形态学的变化有关。关理论的物质基础可能与四君子汤可以增加神经内分泌的调节、 改善大脑神经元突从而提示四君子汤的抗衰老作用机制可能与能改善脑线粒体功能 节能量代谢的缺失突变的作用 四君子 汤有防御衰老模型大鼠脑线粒体 抗自由基作用半乳糖 致衰老模型大鼠空间学习记忆能力, 具有增强突变的作用,而右归饮则没有此作用。缺失 易缺失区的影响:四君子汤、维生素模型大鼠 有升高趋 ,但饮组、维生素 ,四君子汤可降低衰老模型大鼠脑组织中的影响: 四君子组与单纯模型组比较有统计学差异 )对 有升高趋势;右归饮组、 水平 组织四君子汤可降低衰老模型大鼠脑 君子组与单纯模型组比较有统计学差影响:四 )对 水平,而四君子汤的作用不明显; 模型大鼠脑组织中说明右归 维生 单纯模型组比较无统计学意,四 组与单纯模型组比较有统计学意学学位论文 暨南大四君子汤对 D- 型大鼠抗衰老作用 的实验研究 半乳糖致衰老模AbstractObjective: To study the effect of Sijunzi Tang and Youguiyin influences D-galactose-induced aging rat model of spatial learning and memory ability, free radicals and mitochondrial DNA in rat brain tissue, argument the antiaging mechanism of invigorate the spleen and the kidney, and further expanding the clinical usage scope of Sijunzi Tang and making preparation for development the new antiaging medicine?Methods: 60 healthy male SD mouse were divided into five groups randomly. The aging rat model was induced by intraperitoneal injection of D-galactose except for normal control group. Then fed with Sijunzi Tang, Youguiyin and Vitamin E by gavages respectively. Observation the time and wrong times in water maze test, free radicals change of SOD, MDA, NO, NOS and the effect of mitochondrial DNA deletion in rat brain tissueResults: Sijunzi Tang and Vitamin E could shorten the time and decrease wrong times in water maze test, which could improve the rat spatial learning and memory abilitySijunzi Tang group had more significant statistics difference than the model group in the time of water maze test and Vitamin E group had more significant statistics difference than the model group in wrong times of water maze test. Sijunzi Tang, Youguiyin and Vitamin E could enhance the activity of SOD and decrease the activity of MDA in the rat brain tissue. Compared with the model group, Youguiyin group and Vitame E group had more significant statistics difference, but Sijunzi Tang group had no significant statistics difference. Youguiyin and Vitamin E could increase the activity of NO and NOS in rat brain tissue, but Sijunzi Tang could decrease the activity of NO and NOS. Sijunzi Tang group had more significant statistics difference than the model group. Sijunzi Tang and Vitamin E could prevent from mitochondrial DNA deletion, while Youguiyin could not Conclusion: Sijunzi Tang could improve the rat spatial learning and memory ability; Youguiyin could relieve the damage of free radical in brain tissue of rat aging model, which the function of anti-free radicals to surpass Sijunzi Tang. To NO and NOS, Sijunzi Tang could come down both of them, but Youguiyin could go up both of them. Sijunzi Tang could prevent from the deletion of the brain mitochondrial DNA, the antiaging mechanism of Sijunzi Tang probably could improve the function of mitochondrial DAN3学学位论文 暨南大四君子汤对 D- 型大鼠抗衰老作用 的实验研究 半乳糖致衰老模in brain tissue and adjust energy metabolism, which could make preparation for development the new antiaging medicine. The theory of the spleen and the kidney material foundation maybe was related to Sijunzi Tang could improve the function of nerve endocrine and the morphology of synaptic in brain neuroneKey words? Sijunzi TangYouguiyin aging modelD-galactoseVitamin Efree radicalbehavior mitochondrial DNA4学学位论文 暨南大四君子汤对 D- 型大鼠抗衰老作用 的实验研究 半乳糖致衰老模 主要英文缩写词表?缩写 中文名称 SOD superoxide dismutase 超氧化物歧化酶 CAT catalase酶 POD peroxidase 过氧化物酶 GSH-POD glutathione peroxidase谷胱甘肽过氧化物酶 MDAmalondialdhyde醛 NO nitric oxide NOS nitric oxide synthasenNOSneuronal NOS NOS eNOSendothelial NOS 内皮型 NOS iNOSinducible NOS 型 NOS cNOSconstructive NOS 型 NOS mtDNA mitochondrial DNA线粒体脱氧核糖核酸 PCR polymerase chain reactionOD optical density 光密度值 EB Ehthidium bromideCA catecholamines MAO-B monoamine oxidase type B酶 B MAO-I monoamine oxidase inhibitor 5单胺氧化酶抑制剂单胺氧化儿茶酚胺溴化乙锭聚合酶链反应结构诱导神经原型一氧化氮合酶一氧化氮丙二过氧化氢名称 英文学学位论文 暨南大四君子汤对 D- 型大鼠抗衰老作用 的实验研究 半乳糖致衰老模前?言?衰 老是一个 十 分复杂的 多 环节生物 学过 程, 是生物 界普 遍存在的 一 种 自 然 现9 9 年 月我 ,国6 人的 亿总口 0 1 %到 3 以的度长 %上速增, 5 将到 年达2 8 占人 总21 0 8 达 年到 4 多占人的 亿,总口 / 1 家4 。3义 。?1?中医学对衰老的认识代已概。 时就有说 早 在 , 生 把、 黄帝内经: “阳气者若天与日,失其所则折寿而不彰” 。生、长、天年” “ 人自寿谓 的然命之 已是生命发展的必然规律, 老、 、 壮 人 即 ,。 素问 ?上古天真论曰:百岁乃去。 度 尽其年 而终天, 能形与神俱,故 妄劳 不作, 居有常,起 节 有, 说明人 ”, 时神 不御, , 以散真 耗其, 以房 醉入, ,”在 40 灵枢 ? 论述 天年始?;十华 脏定?四荣” 古 为 。 0 4 以 岁 岁从始 后肝, 1 06变化, 外在老的现衰始出体开起人 50 人认 居而终矣故言善误;九十岁,肾气焦,四藏经脉空虚;百岁,五藏皆虚,神气皆去,形骸独善忧悲,血气懈堕,故好卧;七十岁,脾气虚,皮肤枯;八十岁,肺气虚,魄离,好坐;五十岁,肝气始衰,肝叶始薄,胆汁始灭,目始不明;六十岁,心气始衰,“人生十岁,五 五脏衰老说:颓落,发颇斑白,平盛不摇,故岁左右 ,开始出现形体外观等老化的征象。 异,人类大致。衰老表现的早晚,个体之间有很大的差 ,则“半百而衰也 逆于生乐,起居无节”以妄为常 以欲竭其精, 不知持满 务快其身休息等都有适当的节制与安排,才能达到阴平阳秘、长寿之目的。若“以酒为浆,体要适应外在环境的变化,保持身体健康,精神充沛,必须对饮食、起居、劳动、“其知道者,法于阴阳,和于术数,饮食 而亡者称之夭的寿命是有一定限度的,凡能尽其天年,自然衰老而逝者称之寿;不及天年,早衰天赋之年限。的盛衰。正如内经所言长、壮、老、已的演变,看成是阴阳消长盛衰的结果,认为生长与衰老受制于阳气祖国医学对衰老的认识 黄帝内经制以及预防衰老的进程具有重要的现实意衰老及衰老相关的疾病已成为世界范围内日趋严重的社会问题,研究阐明衰老的机的国龄化度老为高而成,从 205 %, 口的亿, 202 平均每年续以将继人口老年后,。今行列国家龄化口老入人经进国已明我,表 人,占 1.2 达到口已年人上老岁以 60 10 。19 功能的不可逆地、全面地、逐渐丧失1象,是一切多细胞生物在发育成熟后随着时间的推移,而表现出的各个细胞和器官学学位论文 暨南大四君子汤对 D- 型大鼠抗衰老作用 的实验研究 半乳糖致衰老模: 曰 格余 致论 溪? 血耗 精俱, 十以后,七 生至六十、 “人” 张4, 上 500 例 60-105 ,体 、力、 精神 、言语 、动 作和 性的 变化。 1 外形:身高 下降 ,脂 肪沉 积,可 出现 老年瘪。 嘴 2 : 70 ,后 70% 的老人体重不同程度下降。 3 皮年斑和老年疣。 老 皱纹, 出干, 肤现枯 4 5 发 头 :变白 ,脱 发;男 性眉 毛、 鼻毛 、耳毛 以及 女性 上唇 毛过度 生长 。 6 耳: 耳鸣、耳聋, 耳轮 逐渐加 长, 出现 耳垂 皱折。 7 目:视力减 退, 出现 角膜 老年环 ,角 膜浑晶 8 记 力 : 智 9 精、 神易疲。 于劳 动钝 运迟, , 10 男子阳 , 欲大为减退 性 化 : 的 性变1.1 中医衰老学说 出多不的点看 提了种同观和 古至今,从 中医学在探讨衰老的原因和机制方面,5法, 并形成了中医学独特的衰老理 。冀论 敦福等 在 总结 中医文献及各家论述的 基( 1 )( 2( 3 ; 脏虚损说,是中医衰老理论中影响最大的学说之一 )五 ( 4 , 说; , 关 ( 5 说,实( 6 失 ; 运6( 7 周泉 文等 )7虚实 致衰老学说、瘀血衰老学说等 。杜怀棠等 概括 为主 虚说 ,主 虚 实说,主 虚 说7包括肾虚衰老说、脾胃虚弱衰老说、津液不足衰老说;主虚实说包括气虚血瘀衰老学说、脾虚衰老学说、脏腑经络衰老学说、精气神衰老学说、气血阴阳衰老学说、认为中医衰老学说大体包括肾虚衰老 多虚实因素并存综合致衰说。)气 常说,认为体内之气,运行失常,可导致内环境紊乱而致衰老和早夭认为增龄中产生的病理产物或外邪导致衰老加速,邪实主要以痰、瘀、积滞为主;)邪 认为衰老与增龄中出现的阴阳偏盛偏衰有 指出阴阳平衡的重要性)阴阳失调 当;)后天说,认为人的衰老进程和寿命主要取决于后天摄养是否得 父母遗传基础;先天说,认为人的衰老进程和寿命取决于 础上提出衰老学说主要有以下几种:痿,女子阴道萎缩,老年褐色素沉着增加。振, 言语重复罗嗦言语、 动作: 精神不 忆力和理解力均减退。 浊, 体浑浊。头发 牙齿: 牙齿松动和脱落。皮肤: 岁以 体重 性驼背、总结出人体衰老的十大外在特征,即外形 重、皮肤、牙齿、头发、耳、目、智岁老人的调查、分析、研究 在综合古人论述的基础 通过 勉之脱眼花,久坐?睡,未风先寒,食则易饥,哭则有泪,但是老境,无不如此。头晕目眵,肌痒尿数,鼻涕牙落,涎多寐少,足弱耳聩,健忘眩晕,肠燥面垢,发丛生。 元代名医朱丹年为周期,按照五行相生规律,逐一趋向衰弱,各种老年表现相继出现,从而老态学学位论文 暨南大四君子汤对 D- 型大鼠抗衰老作用 的实验研究 半乳糖致衰老模。1.1.1 肾虚衰老说: 作特 用肾为先天之本” “ 故代家 历医称 主宰生命, , 殊 , “生命之根” 肾 。于 , 问 ? : 曰 天真论 上古 二 发。 长 肾太 冲? , 丈 形而子。 故坏无也 地不, 道通。7 以 年 8 期 子 周 3540 以 子 岁 4964明肾气 说 体也日渐衰颓。 形 育能 生无, 精难, 气充 月经闭止, 天癸竭, , 左 岁右且 、 衰 , 、衰老 速度的快慢及寿命的长短。 医学入 门 亦曰 : “人至中年,肾 气自衰 ” , 医学: “肾气盛则寿延,肾气衰则寿夭。 ”强调肾虚、肾气的衰弱是衰老的中心阳 。 会 、 肾, 阳 若精 肾、体气衰 人肾渐, 随年增, 着龄长, 肾 致血而; 使寒凝 难 肾不, 阳足1.1.2 脾虚衰老学说 : 素问 ? : 曰 上古天真论 面 阳脉,明衰 五,?七始” 发堕 , 清 确提出阳明脉衰是女子最早出现的衰老变化。明 , ? 五 “ 叶天士有8始焦“女子?胞代谢与生命活动,毒害机体。畅;血行不畅,不仅使脏腑得不到正常滋养,而且致使代谢废物堆积体内,阻碍细致使血粘而滞;肾精不足,水不涵木,经脉失常,血管硬化,致使脉不通,血行不致使气虚而血瘀; 以温养血脉, 阴不足, 虚火炼液从病理上看, 肾虚使元气不足, 无力推动血液运行,于感冒。 肾气之虚进一步累及肾阴、 产生阴虚 虚的各种症状足,煦养卫外失常,并影响其外腑功能,可见腰痛膝酸,疲乏喘息,尿后余沥,易面焦形坏,耳鸣眼花,发堕齿槁,身体重,行走不正等症。肾精不能化气,肾气不耳面发瞳,致身材变矮,腰弯背驼,不能久立;行则振掉,易于骨折;健忘痴呆,环节。从症状上看,人之衰老,肾精亏损,不能充养骨髓和脑髓,不能循阳脉上荣正传曰在生长、 发育 老过程中起着主导作用 肾气的强弱很大程度上决定衰老与否岁、男子 后,肾气渐衰,生气日减,五脏六腑精华随之日损;女 男子岁、 年为 ,女 为周期,男子 该文指出了肾气的盛衰规律:女子以五八,肾气衰,发堕齿槁,八八,天癸竭,精少,肾藏衰,形体皆极,则齿发去”脉衰少, 天癸竭, 夫八岁, 肾气实, 发长齿更七而天癸至,任脉通,太冲脉盛,月事以时下,故有子。?七七,任脉虚,“女子七岁, 气盛, 齿更 素 说源 黄帝内经虚与衰老的相关学肾在中医脏腑学说中占有重要的地位, 其功能广泛,致衰的论点为各种学说的中心。总之对衰老机制的探讨,以虚立论者居多,其中以肾虚致衰、脾虚致衰、脾肾虚损说、 肾虚血瘀衰老说、 脾肾两虚夹瘀衰老说、 多脏器虚损与气滞血瘀痰浊衰老说等学学位论文 暨南大四君子汤对 D- 型大鼠抗衰老作用 的实验研究 半乳糖致衰老模” , “高年阳明气乏”之说,也支持这一论点。阳明脉衰,也就是,气血生 、营卫经络、形体官 胃虚。胃后之化之源,人体脏腑器官脾的衰脾为天本窍, 无不仰仗脾 胃, 元 气 之 滋 养 全 在 脾胃, 五 脏 六腑皆 受 气 于胃 。 素 问 ? 玉机真: “五脏者,皆禀气于胃,胃者五脏之本也?。 ” 枢 ? : “胃者,五脏 六腑之海也 ,水 谷 皆 入 于 胃 , 五 脏 六腑 皆 禀 气于胃 。 ”脾 胃健 旺 水 谷精微 化 源出: “ 元气之充足 ,皆由脾 胃之气无所 伤, 而 后 能 滋 养 元 气。 若胃 气 之 本弱, 饮 食诸病所由生也。 而 而气不充 元亦能, 脾胃之气既伤, 则 倍 自, ” : 云 本草纲目者万 物之母,母 得其 养 , 则 水 火 既 济 , 木金 交 合 ,而诸 邪 自 去, 百病 不 生 。 ”脾主也死。 人就亡 的升降出入一旦停止,气 本 根, 问 ? 六微旨大论 “ , 曰 :” 2?现代医学衰老机理的研究20 机衰老 , 术与技理论物学胞生与细物学子生入分学引年医着老随 纪期 世后,8, 9平 已提了系 经出一 半个世纪以来, 近 。10总重的老说要 结要衰学主溶酶体 线粒体损伤衰老学说、 体细胞突变衰老学说、 老说:胞衰学、 衰学有细膜老说缩 分 粒 说 ; 学 说 学、自 、 修缺衰学、 复陷老说羰 。 酶基衰学、 非糖化老说 、11 歆 1 年名者 著学 Harman 说 提 Free 12,13 14radical theory, 多研究 并得到众9认为其中最具有代表性的衰 的支持。 王桔红等出的自由基学 956 的是最深影响其中认为 陈瑾氧化衰老学说 基毒化衰老学说和微量元素衰老学说等等、学说程控说短学 学说衰老由基 学说、 衰老修饰基因 DNA衰老 褐素脂 程控 学说极限分裂细胞 有:端 学说衰老平的子水水平的衰老学说、细胞水平的衰老学说和分子水平的衰老学说等,其中细胞水平的有:整体水平的衰老学说、器官 列衰老学说,印大中等理的研究开始从整体水平发展到了分子水则无以生长壮老已,非升降则无以生长化收藏。故非出入 素升清,胃主降浊,脾胃是人体气运动的枢机,气的升降出入运动是人体生命活动的“土盛衰,并非完全取决于先天禀赋,与脾胃运化水谷精气的功能密切相关。李东垣指脾胃之气充沛,元气得以滋养而充足,若脾胃之气受损,则元气不充。所以,元气肾,由肾中精气所化生。肾中精气以先天之精为基础,又赖后天水谷精气的培育。充,则体弱多病,而易早衰损寿。中医学认为元气是维系生命的根本,元气根源于充足,精气充盛,脏腑功能强盛,则形健神旺;脾虚化源不足,气血亏虚,元气不五味 灵 藏论曰旬有四,阳明脉衰学学位论文 暨南大四君子汤对 D- 型大鼠抗衰老作用 的实验研究 半乳糖致衰老模” 、 ” “衰老的端粒学说 、 D AN 。 ?伤 损2.1 自由基与衰老2.1.1 自由基的产生 基 Free radical 是指能独立存在, 外层轨道含有未配对基O? 、羟自 基 由 ?OH ) 、氢自由基 H ? 、碳 由基、脂 自 由 自 等 基 。自由基中以-2对 机危 体害 最 ?OH 的化学性质最活 泼,几乎是全 氧反 部化 的 应15是体内各种代谢反应产生的内源性 二 ;( 其产生的主要途径有 内源性自由基是人体自由基的主要来源, 由, 自基 1 )16基 线 :H O 如 。2素 b556 ( 2 ) 经微粒体混合功能氧化酶等催化底物羟2.1.2 自由基的高活性与作用 , 物 低浓度自由, 但由含未对子 自基有配电,素 E 等 )的产 生和 清除 处 于 动 态平 衡 。 清除自由基 的酶类主 要有 超氧 化 物 歧 化酶 superoxide dismutase , SOD、 catalase , CAT 过 、 peroxidase , PODglutathione peroxidase , GSH-POD 它们的主要功能是及时清 , 等10基没有被及时清除,过量自由基在体内堆积就会引发一系列自由基反应:自由基与但随着年龄的增长或在疾病状态下,抗氧化酶的活性呈下降趋势,此时大量的自由健康状态时,各种抗氧化酶活性很高,能及时清除机体代谢过程中产生的自由基,除机体生成的过量自由基,以防自由基对组织细胞产生毒害作用。据研究,机体在胱甘肽过氧化物酶和谷 氧化物酶 过氧化 氢酶可清除过量的自由基, 使自由基 自由基的酶类和小分子抗氧化剂 (如维生可引发链式自由基反应,过量的自由基会损伤机体。正常情况下机体内存在能清除基是机体执行正常生理功能所必需, 具有高度反应活性自由基是机体代谢正常的中间产产生自由基。化产生的线粒体外自由基。此外,机体血红蛋白、肌红蛋白中还可通过非酶促反应处; 素蛋白和复合体的细胞色还原电位较低的部位出现电子泄漏,就会产生自由基,其常见部位是复合体I中黄果呼吸链 位, 一般情况下一分子还原氢、 两个电子经呼吸链传递给氧生成粒体呼吸链是细胞有氧呼吸的重要部 体呼吸链电子泄漏产生线粒体内自由经线粒质等导致共价键均裂产生的外源性自由基自由基。人体内自由基的产生有两方面:一是环境中的高温、辐射、光解、化学物中介物质,可与任何部位的任何生物大分子发生反应,是最活跃、最具有损伤性的大,其中 氧自由基电子的原子、原子团或特殊状态的分子,主要包括:氧自由基(如超氧阴离子自由自由学说”等 “线粒体 老学说有“自由基学说学学位论文 暨南大四君子汤对 D- 型大鼠抗衰老作用 的实验研究 半乳糖致衰老模polyunsaturated fatty acid , PUFA 白质发生过氧化反应生成 、酶、蛋脂 白、 蛋质 、 起质 引脂、 。 DNA , 重的失 要酶活 DNA 从 突, 变机体 组织 或血液 中的抗 氧化 酶活性 和 脂质过氧 化 物 LPO 是 反映机体 衰 老的一 项重17标 。 2.1.3 自由基与膜损伤 ,通过自由 :自由基与多不饱和脂酸发生脂质过氧化反应提 PUFA生 PUFA于 PUFA 要 主2.1.4 自由基与蛋白质损伤 引 能 生 , :18,20Stadtman ER 等内的 氧化 蛋白 羟基化蛋白 增加,最 终氧 化蛋 白质积 聚、沉积 ,使重要 功能蛋白质; 此外, 脂质过氧化的分解产物醛类 主要是烯醛 基 NH 22.1.5 自由基与 DNA 损伤 使 酸有核团 核含亲基, : DNA使 DNA 烷 链。 2.1.6 自由基反应的中间产物与衰老 经典的自由基-衰老学说认为自由基直、 4 细可 在 化学性质活泼, , 物化羰醛丙 合基等二 -羟基壬烯醛、: ( 1- 成 羰 Schiff11交联可发生在 碱,这种 离氨基反应,两分子蛋白质通过 氨反应交联生)羰-氨反应:醛式产物与蛋白质游 胞内广泛扩散,引起细胞成分继发性损伤中间产物如丙烯醛分,故不能解释自由基引起的持续而广泛的损伤。而自由基反应产生的醛、酮结构基团,自由基直接引发的自由基反应不能在细胞内传播,不能损伤远距离的细胞成产物对细胞的损伤在衰老机制中扮演着更重要的角色。因为活泼的自由基是短寿命接引发的自由基反应是衰老机制的基础,但近年的研究认为自由基反应产生的中间基因序列改变、基因突变,进而引起衰老现象化断裂,导致 链聚积。同时脂质过氧化反应的产物烯醛与核酸反应,自由基能与其碱基反应进程。反应使蛋白质分子交联引起蛋白质积聚。氧化蛋白的增加及其功能改变推进了衰老也能与蛋白质的氨 如酶失活研究发现衰老细胞内的羰基含量增多, 细胞 起蛋白质分子交联。物体内的自由基与蛋白质发生过氧化反应透性和硬度增加,细胞内环境稳定性改变。存在于细胞膜磷脂中,故脂质过氧化反应主要损伤生物膜,引起膜通间分子重排、交联。由 作用,引发链式反应,放大自由基的作用,最终发中的氢,生成脂质过氧化物。这些氧化性产物进一步与其他细胞成分 基抽要指而引起衰老各种现象的发生。 因此检测 导致膜损伤,过氧化物 蛋白质分子交联沉积, 损伤重要的酶 类、多不饱和脂酸学学位论文 暨南大四君子汤对 D- 型大鼠抗衰老作用 的实验研究 半乳糖致衰老模。 使 ,DNA 加 衰老进程; 速 断, 裂 、 烷化 ( 2 基巯化物 烯与基合 )质如 谷胱 甘肽 GSH 等, 生成 加成物 后巯 基失 活, 使蛋白 质和 酶功 能受 损。特 别是含 有两个或多 个功能基团的 羰基化合物 Dmcarbinyls , DMCS , 其反应活 性更强,。 泛发物分交和集 广引生大子联聚, , 该理论认为 DMCS 的毒害可能是生212.2 端粒学说与衰老 家 Harley 于 1990粒 端粒 ,是位 于染 色体 末端 的帽 状结构,是 在 DNA 复制 , 时 DNA 聚合不酶 能完 全复制的DNA 分子 3 防染体 止色 形的 成, 端 末而22,24末 端 被 酶解 或两条染色 体的 端 区 融 合、 丢失或重排 。端粒 的长 度 依 赖 着端 粒DNA 式基列元 碱序单 串 联 50 200bp 失 DNA到 有 , 4000bp 就能护 不保。 细 亡 , Bryma 研25,26寿命延长 , 多 粒成能 端合 粒酶是一种核酸核蛋白, 端 。 DNA 修 ,粒使 其延 长, 正 常 人 细胞 一 般 在胚胎发育 期间均不 再产 生这 种 酶 生殖细 胞除 外 ,27。 2.3 线粒体 DNA 与衰老, 体 DNAmitochondrial DNA , mtDNA2.3.1 人类 mtDNA 的遗传特性 mtDNA12位于细胞核外并具有特定的分子结构,因此表现一系列独特的遗 由于已成为国内外研究衰老机理的热点之一,主要体现在以下方面:突变与衰老研究异常活跃, 关于线粒 目前因此端粒随着细胞分裂进行性地缩短导致细胞的衰老,从而使器官的功能老化复被损伤的端端粒酶的活性越高,端粒就越长,染色体的稳定性、完整性越好,细胞分裂次数增究发现, 端粒的长度与端粒酶的活性有关, 染色体的稳定 胞最终死核苷酸丢失, 当端粒缩短到一定程度, 序列 细胞衰老时约的速度丢 数量,正常人体细胞一般以其功能是保护染色体的完整性和稳定性,的长度与衰老和寿命密切相关。 端粒又称端区 认为位于染色体顶端的染色年提出的一个新的衰老学说。他 端粒学说是由美国抗衰老专,较自由基自身引发的反应更为重要。 物衰老的核心过程这就是目前引起广泛重视的羰基应激衰老理论能自发与许多重要生物基团反应 加速细胞衰老式产物中的烯基反应,形成加成物。机体内含巯基的化合物多为重要功能酶和蛋白反应: 巯基化合物能与醛不仅是蛋白质,凡是含有游离氨基的化合物如核酸碱基等均可发生羰-氨反应,使蛋白质内部或分子间, 多次交联后形成大分子 蛋白质变性失活, 功能受到影响学学位论文 暨南大四君子汤对 D- 型大鼠抗衰老作用 的实验研究 半乳糖致衰老模1多数人体组织细胞的单个线粒体中含有数百个乃至数千个 mtDNAmtDNA 拷贝 而 , 2 个 DNA 以 所 , 拷贝2 mtDNAmtDNAmtDNA , 很少 主原是 要因和 由 mtDNAmid-piece 精中 子 因 分 , 此 部 , mtDNA 很少进入受精卵28 合 , 受精卵中的 mtDNAmtDNA293 mtDNA 突变速率是核 DNA 的 10 100 倍 。mtDNA 无效的 ; 组蛋白包被而呈裸露状态容易引发突变 没有 DNA统和 氧化 磷 酸 化 过 程 产 生 的活性 氧 ROS 和自 由基 在微 环 境 中 连 续 积 累 使突变 率 明mtDNA DNA 。 4 mtDNA 不DNA 以 ,所 那样易产生遗传重组, mtDNA 变5 mtDNA 具有异质性 heteroplasmy replicative segregation mtDNA 与野生型 mtDNA变的和野生型的 突 , 复制分离即在细胞分裂的复制过程中 细内现。 个胞的象 mtDNA变 mtDNA 杂合体向突变纯合或野生变积累的程度不同突 易生变累 故产突积。 因突变复制具有优势,但 合向变 纯方转, ,mtDNAmtDNA 的不同程度的选择 和 淘 汰 , 在 迅 速 分 裂 的 组 织 中 如造血干 细 胞 , mtDNA易向 正常 野生 型 方 向 发展 , 而 在分裂不活 跃的有丝 分裂 后细 胞 中 如神经 细胞 ,则mtDNA 。 倾向 6 mtDNA 变 突 mtDNA了 mtDNA ,增加少量的突 表达的能量阈值。接近能量阈值的细胞和组织变 mtDNA 可能使个体出现临床症状。就 , 7 mtDNAbottle neck effect 影响。 mtDNA 在由母体向子代传递过程中有一个大幅度的削减,的 mtDNA 是个 但一 。 应称为瓶颈效应 一效这 ,同 mtDNA 频率、不同的致病程度和比率尚不能通 突变13家系内不同成员表现出的不使后代组织和细胞含有少数卵母细胞在母子传递过程中受瓶颈效应时即达到突变导致氧化磷酸化水平降低,当能量降低到维持组织正常功能所需能量的最低值具有能量阈值效应。 有一定程度的积累突变在群体中的多态性程度也不同。另外,细胞分裂过程中还存在对突变 突变随机进入子细胞的过程。复制分离的结果使突以不同的比例共存于一 异质性即突变 的特点。和复制分离 各种突变的连续累积。异的唯一途径是母系传递过程中 像核高数倍至数十倍 与有毒物质的结合频率比核 显增加;修复系 原因是:有的细胞质遗传方式进行传递。以特 主要来源于卵细胞;精细胞的细胞质表现原因不明的失活。因此,父系和母系的细胞质很少在一个受精卵细胞质中混 中;在受精早期被排除 此, 中段位于其尾部的 于精子中的线粒体 受精卵的是通过卵细胞遗传,精子提供给 中,表现为严格的母性遗传,即绝大部分因位于细胞质 细胞质中的线粒体与细胞核在遗传组成上具有较大差异。细胞核中仅有 如卵母细胞线粒体有几千个拷贝 传特性:学学位论文 暨南大四君子汤对 D- 型大鼠抗衰老作用 的实验研究 半乳糖致衰老模8体细胞 mtDNA 突变和性细胞 mtDNA30。 9 老 快 衰 mtDNA 度 着细胞衰老 随 。剧了对 累基自氧活 加积由和性, 同时, 线粒体呼吸链组成因子的功能下降。mtDNA 。 突变的频率和速度明显增加 2.3.2 线粒体 DNA 突变 leu2.3.2.1 变 ?线粒体 DNA ( 1于 tRNA上 3243 位点 的 A G 突变, 引起 线粒 体 脑 肌 病 伴 乳 酸血 症和 卒 中 样 发 作 ; ( 2 ) ly5tRNA 基因 8344 的 A G 伴; ( 3 ) ATP 酶 6 基因 8993 T G 见于母系遗传疾病? 常 变 突,; ( 4 ) ND 基因 11778 的 G A4Ile引 起 , Leber tRNA 4269 位31A G 在有 65 DNA 测到 调控区检 41432T G 。 2.3.2.2 缺失突变缺失突变较常见的是 4977bp 的缺失,在各脏器 片段 骨 心、33肾 等 、 。 均可见到,称之为共同缺失 Liu 等 到 观察 mtDNA 4977bp 骨在为 0.015 0.3%肌为 0.0003 0.004% 为 0.0001 0.001% 另 。于 , 入 Kearns-Sayre 视 、 表为外瘫 现眼肌痪、 进行性眼外肌瘫痪以及 慢性 Pearson 综合征 胰功衰 腺能竭 、 少 根鼠在 背大 来又有研究发