细菌的革兰氏染色及染色液的配制.doc

革兰氏染色的一般步骤革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用结晶紫染色1分钟后水洗，然后加革兰碘液媒染一分钟后用酒精脱色，再用稀释石炭酸复红复染。染色后除可以看到细菌形态外，还可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G）。被酒精脱色复染成红色者为革兰氏阴性菌（G）。革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因素有关。致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等属革兰氏染色阳性菌。百日咳杆菌、大肠杆菌（大肠埃希菌）、铜绿假单胞菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、沙门菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等均属革兰氏阴性菌。所以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。 革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是： 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。 3）纯化水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染1分钟。 5）水洗，用吸水纸吸去水分。 6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。 7）番红染色液（稀）染10秒钟后，纯化水冲洗。干燥，镜检。 染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。实验三 细菌的革兰氏染色法 一、目的要求 了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 二、基本原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decoorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crysta vioet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95的酒精（ethano）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌； 草酸铵结晶紫，番红水溶液，碘液，95%乙醇，载玻片，显微镜等。 四、操作步骤 1涂片将培养24小时的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰12次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2染色 （1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 （3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030秒钟，立即用水冲净酒精。 （4）复染：用番红液染12分钟，水洗。 （5）镜检：干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 （6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合制片，作革兰氏染色对比。 注意：革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 五、实验结果与讨论微生物染色液的配制一、吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液 A液：美蓝(methylene blue) 06g 95%酒精 30ml B液：KOH 001g 蒸馏水 100ml 分别配制A液和B液，配好后混合即可。二、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液 A液：碱性复红(basic fuchsin) 03g 95%酒精 10ml B液：石炭酸 50g 蒸馏水 95ml 将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解，配成A液。 将石炭酸溶解于水中，配成B液。 混合A液及B液即成。通常可将此混合液稀释510倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。三、革兰氏(Gram)染色液 1草酸铵结晶紫染液 A液：结晶紫(crystal violet) 2g 95%酒精 20ml B液：草酸铵(ammonium oxalate) 08g 蒸馏水 80ml 混合A、B二液，静置48小时后使用。 2卢戈氏(Lugol)碘液 碘片 10g 碘化钾 20g 蒸馏水 300ml 先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。 395%的酒精溶液(脱色用)。 4番红复染液 番红(safranine O) 25g 95%酒精 100ml 取上述配好的番红酒精溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即成。四、芽孢染色液 1孔雀绿染液 孔雀绿(malachite green) 5g 蒸馏水 100ml 2番红水溶液 番红 05g 蒸馏水 100ml 3苯酚品红溶液 碱性品红 11g 无水酒精 100ml 制法取上述溶液10ml与100ml5%的苯酚溶液混合，过滤备用。 4黑色素(nigrosin)溶液 水溶性黑色素 10g 蒸馏水 100ml 称取10g黑色素溶于100ml蒸馏水中，置沸水浴中30分钟后，滤纸过滤二次，补加水到100ml，加05ml甲醛，备用。五、荚膜染色液 1黑色素水溶液 黑色素 5g 蒸馏水 100ml 福尔马林(40%甲醛) 05ml 将黑色素在蒸馏水中煮沸5分钟，然后加入福尔马林作防腐剂。 2番红染液 与革兰氏染液中番红复染液相同。六、鞭毛染色液 A液：单宁酸 5g FeCl3 15g 蒸馏水 100ml 福尔马林(15%) 20ml NaOH(1%) 10ml 配好后，当日使用，次日效果差，第三日则不宜使用。 B液：AgNO3 2g 蒸馏水 100ml 待AgNO3溶解后，取出10ml备用，向其余的90mlAgNO3中滴入浓NH4ON，使之成为很浓厚的悬浮液，再继续滴加NH4OH，直到新形成的沉淀又重新刚刚溶解为止。再将备用的10mlAgNO3慢慢滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失，再滴入AgNO3，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。如所呈雾不重，此染剂可使用一周，如雾重，则银盐沉淀出，不宜使用。七、富尔根氏核染色液 1席夫氏(Schiff)试剂 将1g碱性复红加入200ml煮沸的蒸馏水中，振荡5分钟，冷至50左右过滤，再加入1mol/LHC120ml，摇匀。待冷至25时，加Na2S2O5(偏重亚硫酸钠)3g，摇匀后装在棕色瓶中，用黑纸包好，放置暗处过夜，此时试剂应为淡黄色(如为粉红色则不能用)，再加中性活性炭过滤，滤液振荡1分钟后，再过滤，将此滤液置冷暗处备用(注意：过滤需在避光条件下进行)。 在整个操作过程中所用的一切器皿都需十分洁净、干燥，以消除还原性物质。 2Schandium固定液 A液：饱和升汞水溶液 50ml升汞水溶液加95%酒精25ml混合即得。 B液：冰醋酸 取A液9毫升+B液1毫升，混匀后加热至60。 3亚硫酸水溶液 10%偏重亚硫酸钠水溶液5ml，1mol/LHCl5ml，加蒸馏水100ml混合即得。八、Bouin氏固定液 苦味酸饱和水溶液 75ml 福尔马林(40%甲醛) 25ml 冰醋酸 5ml 1g苦味酸可制成75ml饱和水溶液。 先将苦味酸溶解成水溶液，然后再加入福尔马林和冰醋酸摇匀即成。九、乳酸石炭酸棉蓝染色液 石炭酸 10g 乳酸(比重121) 10ml 甘油 20ml 蒸馏水 10ml 棉蓝(cottonblue) 002g 将石炭酸加在蒸馏水中加热溶解，然后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，使其溶解即成。十、 瑞氏(Wright)染色液 瑞氏染料粉末 03g 甘油 3ml 甲醇 97ml 将染料粉末置于干燥的乳缽内研磨，先加甘油，后加甲醇，放玻璃瓶中过夜，过滤即可。十一、美蓝(Levowitz-Weber)染液 在52ml95%酒精和44ml