c-bsa的制备.doc

c-bsa的制备牛血清白蛋白 提高牛血清白蛋白（CBSA）的等电点，能诱发原位免疫复合物型的肾炎，机制已有证实1。CBSA通过注射进入动物体内可以种植于肾小球的基底膜（GBM），并且与带阴性电荷的GBM发生沉积反应而诱发肾炎2。本实验设计并优化了稳定阳离子化牛血清白蛋白的合成方法，并初步验证了应用该产物建立原位复合物型肾炎模型。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 杂系、雄性大耳白兔，体重（2.20.3）kg，尿蛋白定性（-），由天津实验动物中心提供。1.1.2 CBSA制备所需试剂 牛血清白蛋白(BSA)，Sigma公司；碳化二亚胺(EDC)，Sigma公司；无水乙二胺(EDA)，AR.，天津市化学试剂一厂提供；两性电解质pH 410（Ampholin），北京军事医学科学院；透析袋，中国科学院血液研究所。1.1.3 电泳材料与设备 电泳仪：DYCP36电泳仪(北京六一电子仪器厂)；糜蛋白酶（pI=8.1）、细胞色素C（pI=9.8）、大豆胰蛋白酶抑制剂（pI=4.55），均由Sigma公司提供。其余试剂均为A.R.级。1.2 方法1.2.1 CBSA制备工艺 取700 ml乙二胺（一水），加上5 L双蒸水，再加3.5 L 6 mol/L的盐酸，调pH 4.75，搅拌均匀，冷却至25。搅拌中加入300 ml BSA（溶60 g BSA）水溶液，然后加24 g EDC，25搅拌反应6小时，再加入300 ml 4 mol/L pH 4.75的醋酸缓冲溶液，终止反应后，加入粉末硫酸铵使其饱和度达到0.7，搅拌均匀，静置8小时以上，离心收集沉淀，溶于500 ml水，溶液对水透析除盐48小时，离心收集上清液，冷冻干燥获得粉剂成品。1.2.2 等电聚焦电泳验证 凝胶面积为9 cm9 cm；7.5%丙烯酰胺凝胶，含40%两性电解质载体7%，两电极间相距7 cm。加样纸上样后电泳：先恒压60 V 15分钟，再恒流8 mA入胶。但电压上升到550 V，关闭电源，取出加样纸，调节电压580 V，继续电泳到电流降到0时，将电压调到0，关闭电源。电泳时间16小时。1.2.3 动物模型的建立 实验组：15只大白兔，耳静脉注射CBSA，25 mg/（次日)，第4周起注射剂量增至50 mg，2周后处死；NBSA组：10只大白兔，耳静脉注射NBSA，25 mg/(次日)，第4周起注射剂量增至50 mg，2周后处死；阴性对照组：10只大白兔，未经免疫。 实验指标包括尿蛋白定性、尿蛋白定量和病理学检查。免疫6周后动物肾脏标本分别进行HE染色计算每个肾小球内的细胞数量和测量肾小球直径并观察特征性病理变化，PAS染色检查基底膜和系膜区病变，免疫组织化学检查肾小球内有无IgG、C3和FRA沉积。2 结果2.1 CBSA合成 由NBSA制备得到的CBSA经冷冻干燥得到48.2 g白色片状晶体，收获率80.33%。2.2 等电聚焦电泳验证等电点 NBSA，pI=5.5；CBSA，pI=8.6。标准蛋白分别为：糜蛋白酶，pI=8.1；细胞色素C，pI=9.8；大豆胰蛋白酶抑制剂，pI=4.55。2.3 实验动物指标2.3.1 尿蛋白定性 免疫前各组尿蛋白定性均为阴性，实验组动物免疫后第2周首先出现尿蛋白（12/15）；4周后全部出现尿蛋白（15/15）；增加剂量后尿蛋白普遍大幅上升，6周后（）者占10/15。NBSA组最早出现尿蛋白是在第5周末（2/10），6周后仍未全部阳性（4/10）。阴性对照组未见尿蛋白。2.3.2 尿蛋白定量 免疫前和阴性对照组动物尿蛋白定量无法测出。免疫6周后实验组尿蛋白定量平均为（255.856.2）mg/24小时，NBSA组平均为（24.18.4）mg/24小时，二者差异有高度显著性（P0.001）。2.3.3 病理学检查 光镜检查显示实验组肾脏病变明显，具备早期膜性肾病的病理特点。实验组与NBSA组及对照组肾小球直径和细胞数差异均存在高度显著性（P0.05）。免疫组化检查显示实验组免疫6周后IgG、C3和FRA全部阳性，IgG、C3荧光强度（14/15），（11/15）。免疫荧光显示IgG、C3呈弥漫性颗粒样沿肾小球基底膜（GBM）沉积；FRA呈弥漫性颗粒样沿GBM或沿系膜区沉积。NBSA组C3弱阳性（6/10），IgG和FRA偶见阳性。阴性对照组IgG、C3和FRA全部为阴性。3 讨论 多数学者认为原位免疫复合物的形成和循环免疫复合物在肾小球的沉积在肾炎发病中的机制是共同存在的3。章友康等4采用荧光标记的抗BSA抗体发现CBSA能种植于肾小球GBM，而NBSA则无法检出。本文优化了传统的CBSA的制备工艺，加入硫酸铵阻止牛血清白蛋白阳离子在pH 4.75环境中的平衡移动，增强阳离子化的稳定性，提高了产物的纯度和收获率，这为制备肾炎模型提供了有利条件，避免了CBSA中含有杂质而导致的动物中毒或肾衰竭。用少量的CBSA每日行兔耳静脉注射，可与数周内高效的建立原位免疫复合物型肾炎的模型。制备过程简便，病变典型、稳定，重复性强，是非常理想的肾炎模型制备方法。应用优化的CBSA制备工艺能更加有效的建立原位免疫复合物型肾炎模型，对于研究肾炎发病机制、病生理变化及药理学实验方面具有重要的意义。 【参考文献】 1 Adler S G,Wang H,Ward H J et al. Electrical charge.Its role in the pathogenesis and prevention of experimental membranous nephropathy in the rabbits J.J Clin Invest, 1983;71(3):487499.2 Border W A，Ward H J,Kamil E S et al. Induction of membranous nephropathy in rabbits by administration of an exogenous cationic antigen J.J Clin Invest, 1982;69(2):451461.3 Couser W G. Membranous nephropathy: a