《RNA的生物合成》PPT课件.ppt

第11章 RNA的生物合成RNABiosynthesis Transcription 王丽影 本章主要内容 第一节原核生物转录的模板和酶第二节原核生物的转录过程第三节真核生物的转录过程第四节真核生物RNA的加工 1 5学时 2 5学时 在生物界 RNA合成有两种方式 一是DNA指导的RNA合成 也叫转录 此为生物体内的主要合成方式 也是本章介绍的主要内容 另一种是RNA指导的RNA合成 RNA dependentRNAsynthesis 也叫RNA复制 RNAreplication 由RNA依赖的RNA聚合酶 RNA dependentRNApolymerase 催化 常见于病毒 是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA为模板合成RNA的方式 转录 transcription 是生物体以DNA为模板合成RNA的过程 转录 DNA和RNA生物合成的比较 1 复制转录1 原料dNTPNTP2 模板DNA两条链DNA一条链3 引物需要RNA引物不需引物4 新连延伸方向5 3 5 3 5 产物子链DNAmRNAtRNArRNA6 主要酶类DNA聚合酶RNA聚合酶解旋 解链酶类 2 引物酶终止因子 DNA连接酶 DNA和RNA生物合成的比较 2 复制过程转录过程模板DNA解旋与解链 因子辨认起始点 形成复制叉 带动全酶解开DNA双链 形成引发体 促使转录起动 合成RNA引物 因子随之脱落下来 3 按A T G C碱基配对在核心酶催化下 规则 合成DNA 使RNA链不断延长 形成冈崎片段 切除引物 填补空隙 因子终止链延长 DNA连接酶连接封口 形成长链DNA 参与转录的物质 原料 NTP ATP UTP GTP CTP 模板 DNA酶 RNA聚合酶 RNApolymerase RNA pol 其他蛋白质因子 原核生物转录的模板和酶Templates EnzymesinProkaryoticTranscription 第一节 一 原核生物转录的模板 DNA分子上转录出RNA的区段 称为结构基因 structuralgene 转录的这种选择性称为不对称转录 asymmetrictranscription 它有两方面含义 在DNA分子双链上 一股链用作模板指引转录 另一股链不转录 其二是模板链并非总是在同一单链上 5 GCAGTACATGTC 3 3 cgtgatgtacag 5 5 GCAGUACAUGUC 3 N Ala Val His Val C 编码链 模板链 mRNA 蛋白质 转录 翻译 DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链 称为模板链 templatestrand 也称作反意义链 相对的另一股单链是编码链 codingstrand 也称为有意义链 5 3 3 5 不对称转录 1 DNA分子上只有一条可转录2 模板链并不总是在同一单链上 RNA合成方向 5 3 不对称转录 asymmetrictranscription 结构基因 转录特点 二 RNA合成由RNA聚合酶催化 一 RNA聚合酶能直接启动RNA链的合成 DNA依赖的RNA聚合酶催化合成RNA RNA合成的化学机制与DNA依赖的DNA聚合酶催化DNA合成相似 NMP n NTP NMP n 1 PPi RNA 延长的RNA NMP n NTP NMP n 1 PPiRNA延长的RNA RNA聚合酶通过在RNA的3 羟基端加入核苷酸延长RNA链 以5 到3 方向合成RNA 总的反应可以表示为 DNA依赖的RNA聚合酶催化RNA的合成机制 DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在 而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长 RNA聚合酶和DNA的特殊序列 启动子 promoter 结合后 就能启动RNA合成 二 RNA聚合酶由多个亚基组成 利福平和利福霉素能结合在 亚基上而对此酶发生强烈的抑制作用 亚基似乎是酶和核苷酸底物结合的部位 细胞内转录是在DNA特定的起始点上开始的 亚基的功能是辨认转录起始点的 亚基是酶与DNA模板结合的主要成分 亚基可能与转录基因的类型和种类有关 RNA聚合酶 核心酶 coreenzyme 全酶 holoenzyme 转录起始阶段 转录延长阶段 RNA聚合酶 E coli的RNA聚合酶全酶 具有 70亚基 识别的典型启动子结构示意 有些原核RNA聚合酶具有与 70不同的 亚基 这些RNA聚合酶所识别启动子的共有序列与含 70亚基的RNA聚合酶所识别的启动子共有序列也不同 例如 识别和结合热休克基因 heat shockgenes 启动子的RNA聚合酶具有的是 32 分子质量32kD 而不是 70 识别与细胞移动和细胞化学趋化 chemotaxis 相关基因启动子的是 28 识别与氮代谢相关基因启动子的是 54 三 RNA聚合酶结合到DNA的启动子上起动转录 转录是不连续 分区段进行的 每一转录区段可视为一个转录单位 称为操纵子 operon 操纵子包括若干个结构基因及其上游 upstream 的调控序列 调控序列中的启动子是RNA聚合酶结合模板DNA的部位 也是控制转录的关键部位 原核生物以RNA聚合酶全酶结合到DNA的启动子上而起动转录 其中由 亚基辨认启动子 其他亚基相互配合 对启动子的研究 常采用一种巧妙的方法即RNA聚合酶保护法 RNA聚合酶保护法 开始转录 TTGACAAACTGT 35区 Pribnowbox TATAATPuATATTAPy 10区 RNA pol辨认位点 recognitionsite 用RNA聚合酶保护法研究转录起始区 RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合 原核生物的转录过程TheProcessofTranscriptioninProkaryote 第二节 RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域 DNA双链解开 使其中的一条链作为转录的模板 一 转录起始需要RNA聚合酶全酶 转录起始需解决两个问题 E coli的转录起始和延长 2 DNA双链局部解开 形成开放转录复合体 opentranscriptioncomplex 1 RNA聚合酶全酶 2 与模板结合 形成闭合转录复合体 closedtranscriptioncomplex 3 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应 形成转录起始复合物 RNApol 2 DNA pppGpN OH3 转录起始复合物 5 pppG OH NTP 5 pppGpN OH3 ppi 转录起始过程 第一个磷酸二酯键生成后 亚基即从转录起始复合物上脱落 核心酶连同四磷酸二核苷酸 继续结合于DNA模板上 酶沿DNA链前移 进入延长阶段 二 原核生物的转录延长时蛋白质的翻译也同时进行 1 亚基脱落 RNA pol聚合酶核心酶变构 与模板结合松弛 沿着DNA模板前移 2 在核心酶作用下 NTP不断聚合 RNA链不断延长 NMP n NTP NMP n 1 PPi E coli的RNA聚合酶催化的转录过程 转录过程中DNA的超螺旋结构变化 转录过程中DNA的超螺旋结构变化 5 3 DNA 原核生物转录过程中的羽毛状现象 核糖体 RNA RNA聚合酶 在同一DNA模板上 有多个转录同时在进行 转录尚未完成 翻译已在进行 这种形状说明 电镜下原核生物转录过程中的羽毛状现象 依赖Rho因子的转录终止非依赖Rho因子的转录终止 三 原核生物转录终止分为依赖 Rho 因子与非依赖 因子两大类 转录终止指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进 转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来 依据是否需要蛋白质因子的参与 原核生物转录终止分为 因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质 46KD 因子能结合RNA 又以对polyC的结合力最强 因子还有ATP酶活性和解螺旋酶 helicase 的活性 一 依赖 因子的转录终止 因子 因子的作用原理 目前认为 因子终止转录的作用是 与RNA转录产物结合 结合后 因子和RNA聚合酶都可发生构象变化 从而使RNA聚合酶停顿 解螺旋酶的活性使DNA RNA杂化双链拆离 利于产物从转录复合物中释放 二 非依赖Rho因子的转录终止 内源性终止子的基本结构 DNA模板上靠近终止处 有些特殊的碱基序列 转录出RNA后 RNA产物形成特殊的结构来终止转录 5 UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU 3 5 UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU 3 RNA 5 TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT 3 DNA 5 UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU 3 近终止区的转录产物形成发夹 hairpin 结构是非依赖 因子终止的普遍现象 内源性终止子的基本结构 1 二级结构中的发夹 长度7 20bp 发夹靠近基部通常有一个G C富集区 2 转录单位最末端的连续约6个U残基组成的片段 这两个特点都是终止所必需的 在大肠杆菌基因组中 符合这些标准的序列约有1100个 约一半 茎环结构使转录终止的机理 使RNA聚合酶变构 转录停顿 使转录复合物趋于解离 RNA产物释放 真核生物的转录过程TheProcessofTranscriptioninEukaryote 第三节 真核生物的转录过程比原核复杂 二者的转录起始过程有较大区别 转录终止也不相同 一 真核生物有三种DNA依赖性RNA聚合酶 真核生物具有3种不同的RNA聚合酶 RNA聚合酶 RNAPol RNA聚合酶 RNAPol RNA聚合酶 RNAPol 真核生物的RNA聚合酶 细胞核中RNA聚合酶的种类 但在细菌中 一种RNA聚合酶几乎负责所有mRNA tRNA和rRNA的合成 所有真核生物的RNA聚合酶都有两个不同的大亚基和十几个小亚基 酿酒酵母的聚合酶 与 有相似与 有同源性 与 有同源性 真核生物RNA聚合酶的结构比原核生物复杂 所有真核生物的RNA聚合酶都有两个不同的大亚基和十几个小亚基 RNA聚合酶 由12个亚基组成 其最大的亚基称为RBP1 RNA聚合酶 最大亚基的羧基末端有一段共有序列 consensussequence 为Tyr Ser Pro Thr Ser Pro Ser的重复序列片段 称为羧基末端结构域 carboxyl terminaldomain CTD CTD对于维持细胞的活性是必需的 羧基末端结构域 carboxyl terminaldomain CTD RNA聚合酶 最大亚基的羧基末端有一段共有序列为Tyr Ser Pro Thr Ser Pro Ser重复序列片段 这一序列在RNA聚合酶 中是独一无二的 所有真核生物的RNA聚合酶 都具有CTD 只是共有序列的重复程度不同 去磷酸化的CTD在转录起始中发挥作用 磷酸化的CTD在转录延伸中发挥作用 RNA聚合酶 最大亚基CTD P在转录延伸中发挥作用 RNA聚合酶 最大亚基CTD在转录启始中发挥作用 磷酸酶 激酶 二 真核转录起始需要启动子 RNA聚合酶和转录因子的参与 一 转录起始前的上游区段具有启动子核心序列 不同物种 不同细胞或不同的基因 转录起始点上游可以有不同的DNA序列 但这些序列都可统称为顺式作用元件 cis actingelement 顺式作用元件包括启动子 启动子上游元件 upstreampromoterelements 或promoter proximalelements 等近端调控元件和增强子 enhancer 等远隔序列 起始点上游多数有共同的TATA序列 称为Hognest盒或TATA盒 TATAbox 通常认为这就是启动子的核心序列 一个典型的真核生物基因上游序列 许多RNA聚合酶II识别的启动子具有保守的共有序列 位于转录起始点附近的起始子 intiator Inr 启动子上游元件是位于TATA盒上游的DNA序列 多在转录起始点约 40 100nt的位置 比较常见的是GC盒和CAAT盒 增强子是能够结合特异基因调节蛋白 促进邻近或远隔特定基因表达的DNA序列 转录起始点 TATA盒 25bp CAAT盒 75bp GC盒 110bp 增强子 顺式作用元件 cis actingelement AATAAA 切离加尾 转录终止点 修饰点 外显子 翻译起始点 内含子 OCT 1 OCT 1 ATTTGCAT八聚体 二 转录因子 能直接 间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质 现已发现数百种 统称为反式作用因子 trans actingfactors 反式作用因子中 直接或间接结合RNA聚合酶的 则称为转录因子 transcriptionalfactors TF 参与RNA pol 转录的TF 基因基础转录 是由核心启动子与通用转录因子结合后起始转录过程 只含有通用转录因子和上游因子识别序列的启动子可在各种细胞类型中发挥作用 可以开始转录但其速率低 如TBP支持基础转录 能被诱导表达的基因启动子 该启动子能被诱导物直接激活 或诱导物与启动子上的阻遏物结合 从而间接激活该启动子的转录 TAFs对诱导引起的增强转录是必要的 型基因中的四类转录因子 三 转录起始前复合物真核生物转录分四个时期 装配期 RNA聚合酶 和通用转录因子形成闭合复合体 启始期延长期终止期 真核生物RNA pol不与DNA分子直接结合 而需依靠众多的转录因子 形成转录起始复合物 pre initiationcomplex PIC 需有关蛋白质参与 PIC装配顺序 2 TF B TBP DNA复合体TF A 稳定复合体 3 TF F与RNA聚合酶 TF B 降低RNA聚合酶 与DNA的非特异性结合 4 TF H有解旋酶活性 打开转录起始点DNA双链 使闭合复合体成为开放复合体 启始转录 5 延长阶段 TF F增强RNA聚合酶 活性 1 TBP与TATABOX结合 TF B与TBP结合 真核RNA聚合酶 与通用转录因子的作用过程 TF F A B H E TP TAF TF D A B DNA复合物 TATA A B TBP TAF TATA H E 闭合复合体组装完成 TF H使CTD磷酸化 真核生物的闭合复合体的组装 RNA聚合酶II与启动子的结合 启动转录需要多种蛋白质因子的协同作用 通常包括 可诱导因子或上游因子与增强子或启动子上游元件的结合 通用转录因子在启动子处的组装 辅激活因子和 或中介子在通用转录因子 RNA聚合酶II复合物与可诱导因子 上游因子之间的辅助和中介作用 因子和因子之间互相辨认 结合 以准确地控制基因是否转录 何时转录 四 少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录 为了保证转录的准确性 不同基因需不同转录因子 拼板理论 piecingtheory 少数几个反式作用因子 主要是可诱导因子和上游因子 之间互相作用 再与基本转录因子 RNA聚合酶搭配而有针对性地结合 转录相应的基因 可诱导因子和上游因子常常通过辅激活因子或中介子与基本转录因子 RNA聚合酶结合 但有时也可直接与基本转录因子 RNA聚合酶结合 三 真核生物转录延长过程中没有转录与翻译同步的现象 真核生物转录延长过程与原核生物大致相似 但因有核膜相隔 没有转录与翻译同步的现象 RNA pol前移处处都遇上核小体 转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象 RNA Pol RNA Pol RNA Pol 核小体 转录延长中的核小体移位 转录方向 四 真核生物的转录终止和加尾修饰同时进行 真核生物的转录终止 是和转录后修饰密切相关的 真核生物mRNA有聚腺苷酸 polyA 尾巴结构 是转录后才加进去的 转录不是在polyA的位置上终止 而是超出数百个乃至上千个核苷酸后才停顿 已发现 在读码框架的下游 常有一组共同序列AATAAA 再下游还有相当多的GT序列 这些序列称为转录终止的修饰点 真核生物的转录终止及加尾修饰 RNA聚合酶缺乏有校读 proofreading 功能的3 至5 核酸外切酶活性 因此转录发生的错误率比复制发生的错误率高 但一个基因可以转录产生许多RNA拷贝 而且RNA最终是被降解和替代 所以转录产生错误RNA对细胞的影响远比复制产生错误DNA对细胞的影响小 RNA聚合酶缺乏校读 proofreading 功能 真核生物RNA的加工Post transcriptionalModificationofEukaryoticRNA 第四节 真核生物转录生成的RNA分子是初级RNA转录物 primaryRNAtranscript 几乎所有的初级RNA转录物都要经过加工 才能成为具有功能的成熟的RNA 加工主要在细胞核中进行 几种主要的修饰方式 1 剪接 splicing 2 剪切 cleavage 3 修饰 modification 4 添加 addition 一 真核生物mRNA的加工包括首 尾修饰和剪接 一 前体mRNA在5 末端加入 帽 结构 大多数真核mRNA的5 末端有7 甲基鸟嘌呤的帽结构 这个真核mRNA加工过程的起始步骤由两种酶 加帽酶 cappingenzyme 和甲基转移酶 methyltransferase 催化完成 帽子结构 5 5 1 1 帽子覆盖了mRNA的5 端 它可在几个位点被甲基化 G A A Guanine 7 methyl transferase 2 O methyl transferase Cap0 10 15 100 5 pppGp 帽子结构的生成过程 帽子结构的意义 可以使mRNA免遭核酸酶的攻击 也能与帽结合蛋白质复合体 cap bindingcomplexofprotein 结合 并参与mRNA和核糖体的结合 启动蛋白质的生物合成 二 前体mRNA在3 端特异位点断裂并加上多聚腺苷酸尾 1 hnRNA和snRNA 核内的初级mRNA称为杂化核RNA hetero nuclearRNA hnRNA snRNA smallnuclearRNA 尾部修饰是和转录终止同时进行的过程 polyA的有无与长短 是维持mRNA作为翻译模板的活性 以及增加mRNA本身稳定性的因素 一般真核生物在胞浆内出现的mRNA 其polyA长度为100至200个核苷酸之间 也有少数例外 前体mRNA分子的断裂和加多聚腺苷酸尾是多步骤过程 慢速多聚磷酸化 AAUAAA G U G U G U AAAAAAAAAAOH PAP AAAAAAAAAAOH AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAOH Poly a 信号 Poly A 位点 CPSF CPSF CPSF CF CF CStF CF1 CF CStF PAP CStF CF CF1 CPSF PAP 剪切 CPSF OHP PAP CStF ATP PPi 降解 P PAB PAB 快速多聚磷酸化 PAB ATP PPi 断裂和聚腺苷酸化特异性因子 断裂因子 断裂激动因子 多聚腺苷酸聚合酶 多聚腺苷酸聚合蛋白 真核生物结构基因 由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成 去除非编码区再连接后 可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质 这些基因称为断裂基因 断裂基因 splitegene 编码区A B C D 2 外显子 exon 和内含子 intron 结构基因中能够指导多肽链合成的编码顺序被称为外显子 而结构基因中不能指导多肽链合成的非编码顺序就被称为内含子 鸡卵清蛋白基因 hnRNA 首 尾修饰 hnRNA剪接 成熟的mRNA 鸡卵清蛋白基因及其转录 转录后修饰 鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图 DNA mRNA 3 内含子的分类 根据基因的类型和剪接的方式 通常把内含子分为4类 I 主要存在于线粒体 叶绿体及某些低等真核生物的rRNA基因 II 也发现于线粒体 叶绿体 转录产物是mRNA III 是常见的形成套索结构后剪接 大多数mRNA基因有此类内含子 IV 是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子 剪接过程需酶及ATP 4 mRNA的剪接 除去hnRNA中的内含子 将外显子连接 snRNP与hnRNA结合成为并接体 真核mRNA前体剪接机制 两步转酯反应 第一步 将内含子5 P与外显子1的3 O之间的酯键转变为内含子5 P与分支点A的2 O之间的酯键 第二步 将外显子2的5 P与内含子3 O之间酯键转变为外显子2的5 P与外显子1的3 O之间的酯键 亲核攻击 带富余电荷的基团进攻带正电性的原子而形成价键 真核mRNA前体剪接机制 剪接体复合体组成 5种snRNA加50种蛋白质5种snRNA U1 U2 U4 U5 U6U2 U6组成催化中心 发生转酯反应 mRNA的剪接 RNA的编辑是某些RNA 特别是mRNA前体的一种加工方式 如插入 删除或取代一些核苷酸残基 一个基因可以产生多种蛋白质近年发现某些mRNA前体的核苷酸序列需加以改编 才能变成正确的有翻译活性的模板 RNA编辑的生物学意义 消除移码突变等基因突变的危害 增加了基因产物的多样性 与生物发育与分化有关 是基因调控的一种重要方式 5 mRNA的编辑 mRNAediting RNA编辑作用说明 基因的编码序列经过转录后加工 是可有多用途分化的 因此也称为分化加工 differentialRNAprocessing mRNA的编辑 mRNAediting