基因组DNA的提取与电泳鉴定.doc

基因组DNA的提取与电泳鉴定一. 【实验目的】 掌握基因组DNA的提取原理和方法二. 【实验仪器与试剂】实验仪器：琼脂糖凝胶电泳系统、紫外反射透射分析仪、离心机、恒温水浴锅实验试剂：氯仿、巯基乙醇、植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）三. 【实验原理】实验中有两种提取DNA的方法，即试剂盒提取法和普通手提法，本次试验采用试剂盒提取法。试剂盒方法：试剂盒中有特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，离心吸附柱是一种硅基质材料，可以高效、专一吸附DNA，最大限度去除植物细胞中杂质蛋白及其他有机化合物。普通手提方法：用机械的方法使组织和细胞破碎，加入SDS等离子型活性剂，溶解细胞膜和核膜蛋白。加入酚氯仿等表面活性剂使蛋白变性。离心，除去组织和变性蛋白，上清液中加入冰冻的无水乙醇使DNA沉淀，离心，弃上清，用70%乙醇漂洗DNA，倒掉上清，风干，溶于灭菌的双蒸水中。四. 【实验内容与步骤】1.取出处理过的新鲜藻体0.1g，用液氮研磨至粉状。2.将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700l 65预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入-巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65水浴中加热20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。3、加入700l氯仿，充分混匀，12000rpm 离心5min。4、小心将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700l缓冲液GP2，充分混匀。5、将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液（吸附柱容积为700ml左右，可以分次加入离心）。6、向吸附柱CB3中加入500l去蛋白液GD（使用前确认是否加入无水乙醇），12000rpm 离心30s，弃掉废液。7、向吸附柱CB3中加入700l漂洗液PW（使用前确认是否加入无水乙醇），12000rpm 离心30s，弃掉废液。8、向吸附柱CB3中加入500l漂洗液PW，12000rpm 离心30s，弃掉废液。9、将吸附柱CB3放入废液回收管中，12000rpm 离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。10、将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。11、将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50l洗脱缓冲液TE，室温放置2min，12，000rpm 离心2min；离心得到的溶液再加入吸附柱C3中，室温放置2min，12，000rpm 离心2min；取出1/10体积提取物进行电泳检测，其余 -20保存备用。五. 【实验结果与讨论】现象描述及分析1. 根据电泳结果可以看出DNA条带亮度较高，说明提取出的DNA含量较高。且拖尾现象较轻，说明可能有部分DNA降解，但是降解程度较小，DNA的完整性保存较好。2. 由电泳结果看出条带位于marker2000bp条带上方，说明提取出的DNA质量大于2000bp，但具体大小不能确定。附图C2 六. 【思考题】 1.简述DNA提取过程中需要注意哪些问题。使用液氮进行研磨时要戴手套，防止冻伤，并保持室内通风。研磨时要保证材料始终处于液氮环境中，不可使液氮完全挥发。研磨要充分，尽量不要外溅，因为收集细胞的多少是实验成功与否的关键。每人所取材料量不能太多,氯仿的加入量不能太少,且要充分摇匀,否则蛋白质变性不完全。2.查阅资料简单介绍通过紫外分光光度计给核酸定量的原理。分光光度计计采用一个可以产生多个波长的光源，通