western blotting 蛋白质印迹实验流程.doc

细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml离心管内，用1PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4离心5min，弃上层液体。洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1PBS约100L，1000r/min，4离心5min后，完全弃上层液体，置于-80冰箱保存备用。（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。（4）13000r/min，4离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80冰箱保存备用。2. BCA法测定蛋白质浓度（1）配制工作液 根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA工作液，充分混匀，置于常温备用。（2）配制标准品 取原标准品BSA（2mg/mL）约100L，取出50L，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20L 1PBS，从第三横排起，按浓度梯度由低到高依次取20L标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。（3）稀释待测样品 取5l待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50L，分别取20L至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；（4）分别加入200L BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37孵育30min。（5）将96孔板取出后用酶标仪测定OD570nm值。（6）根据标准品的OD570nm值绘制标准曲线，并根据标准曲线计算得到待测样品的蛋白质浓度。蛋白质变性（1）根据预计将要上样的蛋白质样品质量（25g-50gg，是蛋白质而定），取适量体积的蛋白质样品于预冷的EP管中，加入5SDS上样缓冲液（体积约为蛋白质样品体积的25%），通过调节上样缓冲液的体积将各样品混合液的终体积调节至相仿。用封口膜将离心管封口，7000r/min离心点离样品混合液3s，使其混合均匀。（2）将放置样品混合液的架子置于盛有适量dd H2O的磁盘中，用电磁炉加温至100，煮沸5min。点离样品，使其混合均匀。2.34.54. SDS-PAGE分离蛋白质根据将要检测的蛋白质大小，首先确定配制10%的分离胶（10ml）：dd H2O 4ml30%Acr-Bis 3.3ml1.0MTris-HCl（pH8.8） 2.5ml10%SDS 0.1ml10%AP 0.1mlTEMED 0.005ml将配置好的液体吹打混匀，灌胶，再用注射器将dd H2O缓慢均匀的加于分离胶上层，待胶凝固后（光下可见明显的水胶分离线）将上层水倒掉，并用滤纸尽量将水吸干（注意不要碰到分离胶）。然后配制4%浓缩胶（3ml）：dd H2O 1.8ml30%Acr-Bis 0.4ml1.0MTris-HCl（pH6.8） 0.76ml10%SDS 0.03ml10%AP 0.03mlTEMED 0.003ml将配置好的液体吹打混匀后，迅速灌胶并马上插入梳齿，待胶充分凝固后放入垂直电泳槽内，加入电泳缓冲液，小心将梳齿拔出，每孔加入等质量变性蛋白质（根据不同的蛋白质具体的上样质量会有所变化，但相同蛋白质的上样质量始终不变）后进行电泳。先采用80V恒压电泳约30min后，改用100V恒压电泳约2h（具体视溴酚蓝跑到胶的最底端的时间而定）。2.34.6 转膜（1）预先裁剪出大小适宜的PVDF膜和滤纸，尽量使PVDF膜面积稍大于凝胶，但不大于海绵。 （2）电泳结束后，将凝胶剥下，小心的将浓缩胶切除，将分离胶浸泡于预冷的转移缓冲液中约15min，洗去杂质。（3）将PVDF膜完全浸泡在甲醇中约30s。（4）在倒满转移缓冲液的塑料盘中依次加入转膜用的夹子（正极一侧在下，保持水平）、一块海绵垫、滤纸、浸泡好的PVDF膜、浸泡好的凝胶、滤纸和另一块海绵垫，整个操作过程中要不断赶走气泡，在夹紧夹子前要确认各层中没有气泡（否则会影响转膜结果）。（5）将夹子放入电泳转移槽中，确认夹子的正负极与转移槽正负极相对，整个转移槽埋在冰中进行转膜。根据将要检测的蛋白质分子量大小确定转膜时间，小分子蛋白一般为恒压80V，1.5h；大分子蛋白一般为恒压100v，2h。（6）转膜结束后打开夹子，小心去除负极一端的海绵、滤纸和胶，在PVDF膜的右上角剪一个角以确定正面，然后取出，根据预染蛋白Marker标准判断转膜效果及目的条带的大致位置。2.34.7 免疫反应（1）封闭：将PVDF膜浸泡于含5%脱脂奶粉的PBST封闭液中（如要检测磷酸化蛋白，则需使用含5%BSA的PBST封闭液进行封闭），室温下摇床摇动封闭约1-2h。（2）剪膜：依据预染蛋白Marker标准判断目的蛋白的条带位置，并将其小心剪下，膜的宽度应适当，并尽量保留周围可能出现条带的位置。（3）一抗孵育：用5%BSA溶液将一抗稀释至适宜浓度，并加入到大小合适的孵育槽中，将剪好的PVDF膜置于其中，稀释好的一抗应当至少没过PVDF膜。4下摇床摇动封闭过夜。（4）洗膜：室温下，用1PBST在摇床上洗涤PVDF膜4次，每次10min。（5）二抗孵育：根据一抗选择相应的羊抗鼠IgG二抗或羊抗兔IgG二抗，用含5%脱脂奶粉的PBST将辣根过氧化物酶标记的二抗稀释至适宜浓度，并加入到大小合适的孵育槽中，将PVDF膜置于槽中，室温下摇床摇动孵育2h。（6）洗膜：室温下，用PBST在摇床上洗涤PVDF膜3次，每次10min。2.34.8 显影（1）用水冲洗好平板，将保鲜膜平整的铺于平板上，并用滤纸赶走气泡，将孵育好的PVDF膜取出置于保鲜膜上，放置整齐，并用滤纸轻轻吸去PVDF膜上的液体；（2）取适量ECL试剂A、B液等体积混合后滴于PVDF膜上，避光孵育5min，用滤纸吸去剩余的发光试剂，并将平板放入凝胶扫描成像系统中，根据荧光强度确定曝光时间（5s-30min）。待成像后将图片以.tif格式保存。（3）用灰度分析软件Quantity One软件对实验结果进行灰度扫描。2.4 5 HDAC组蛋白去乙酰化酶活性比色分析试剂盒检测HDAC活性（1）取对照组和实验组各50g待测蛋白质样品，用ddH2O将其稀释，使终体积为85l，并按0M，1.25M，2.5M, 5.0M浓度依次加入96孔酶标板中。（2）加入10l 10HDAC Assay Buffer。（3）再加入5l HDAC Colorimetric Substrate，彻底混匀。（4）在温箱中37孵育1h。（5）加入10l Lysine Developer并彻底混匀，终止反应。（6）在温箱中37孵育30min。（7）将96孔板取出后用酶标仪测定A450 OD450nm值。将其转化为酶的活性值并进行统计学分析。2.5 细胞周期及凋亡率检测（1）收集实验组和各个对照组K562细胞5106个，1000r/min，4离心5min，弃去上清。（2）1PBS洗涤细胞两次，1000r/min，4离心5min，完全弃去上清。用手指轻弹细胞团，使其分散重悬。（3）每管加入约1