胰岛素基因的获取

胰岛素基因的获取和表达实验 生物技术一班 一、 寻找高表达的靶器官,获取目的mRNA胰脏是胰岛素的高表达器官。胰脏中有胰岛A细胞和胰岛B细胞，胰岛A细胞产生胰高血糖素，胰岛B细胞产生胰岛素。在胰脏中切除含胰岛B细胞较多的组织用于提取目的mRNA1 总RNA的提取总RNA的抽提方法有多种，Trizol试剂是使用组广泛的RNA抽提试剂，只要由苯酚和异硫氰酸胍组成，可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质即核内的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整。提取RNA时，首先用液氮研磨材料，匀浆，加入Trizol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，通过异丙醇沉淀，可获得比较纯的总RNA，用于下一步mRNA的纯化。2 mRNA的纯化该方法利用mRNA 3端含有PolyA的特点，当RNA流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性的结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两次寡聚纤维柱后可得到较高纯度的mRNA。3 . RNA甲醛变性胶电泳 提取样品的总RNA后，一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构，因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳，得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。4. 设计引物根据已知的编码胰岛素的核苷酸序列，设计引物，将目的mRNA筛选出来。5. 合成cDNA用逆转录法以目的mRNA为模板，在逆转录酶催化下合成cDNA。目的mRNA顺序是从NCBI中搜索得到的，数据如下： Homo sapiens insulin (INS) mRNA, partial cds/translation=WGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAED LQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN sig_peptide 285 /gene=INS /note=insulin A chainORIGIN 1 ctggggacct gacccagccg cagcctttgt gaaccaacac ctgtgcggct cacacctggt 61 ggaagctctc tacctagtgt gcggggaacg aggcttcttc tacacaccca agacccgccg121 ggaggcagag gacctgcagg tggggcaggt ggagctgggc gggggccctg gtgcaggcag 181 cctgcagccc ttggccctgg aggggtccct gcagaagcgt ggcattgtgg aacaatgctg241 taccagcatc tgctccctct accagctgga gaactactgc aacta二、 PCR 将提取的目的mRNA，在逆转录酶催化下，合成cDNA,然后利用PCR技术获得大量目的基因。三、 碱裂解法抽提质粒DNA 当目的基因片段10Kbp时用原核细胞质粒作载体，当目的基因片段23Kbp用真核细胞质粒作载体。 质粒是存在于染色体外的小型双链环状DNA，能在宿主菌中自主复制，还能编码一些遗传性状，如抗药性，利用这些抗性可以对宿主菌或重组菌进行筛选。 碱裂解法制备质粒DNA的原理是：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，细胞内含物从细胞中裂解出来，当加入中和液后质粒DNA分子能够迅速复性呈溶解状态，离心时留在上清中，细胞内含物呈絮状。四、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂作支持介质的一种电泳方法。在一定的电场强度下，DNA分子的电泳迁移率取决于DNA分子本身的大小等，通过电泳条带分析提取的质粒DNA的纯度。五、 重组DNA的制备 重组DNA的核心是用限制性内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接。将获取的大量目的基因与质粒混合，加入限制性内切酶和连接酶，制备重组DNA分子。六、 感受态细胞的制备（CaCl2转化法）细菌处于零摄氏度CaCl2低渗溶液中细胞膨胀成球形，细胞壁通透性增强，易于吸收外源DNA。七、 外源DNA的转化受体细胞接受外源DNA分子后就表现出质粒DNA分子所具有的抗性性状，将经过转化后细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子。筛选的方法及原理：取一个LB固体培养基标记为1，取两个加有Amp的LA固体培养基分别标记为2,、3，在1、2上分别接种感受态细胞，在3上接种转化后的细胞。培养24小时后观察现象，若1上长出菌落，2上未长有菌落，说明感受态细胞有活性，且没有被污染，若3上也长出菌落，说明转化成功。八 提取重组DNA 提取重组DNA方法及原理参考三九、 感受态细胞的制备 因为胰岛素不需要经过糖基化就具有活性，所以编码胰岛素的目的基因可以导入原核细胞中，制备