第十七章高效液相色谱法2012s.ppt

第十七章高效液相色谱法 HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC 一 HPLC法的特点 与经典LC法比较 高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的 现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别 不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作 高效液相色谱法是继气相色谱之后 70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术 17 1概述 高效液相色谱 经典色谱 经典的液相色谱法 流动相在常压下输送 所用的固定相柱效低 分析周期长 而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论 流动相改为高压输送 最高输送压力可达4 5 107Pa 色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成 从而使柱效大大高于经典液相色谱 每米塔板数可达几万或几十万 同时柱后连有高灵敏度的检测器 可对流出物进行连续检测 因此 高效液相色谱具有分析速度快 分离效能高 自动化等特点 所以人们称它为高压 高速 高效或现代液相色谱法 二 液相色谱与气相色谱的比较 液相色谱所用基本概念 保留值 塔板数 塔板高度 分离度 选择性等与气相色谱一致 液相色谱所用基本理论 塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致 但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相 而液体和气体的性质不相同 此外 液相色谱所用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不同 所以 液相色谱与气相色谱有一定差别 主要有以下几方面 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质 对高沸点化合物 非挥发性物质 热不稳定化合物 离子型化合物及高聚物的分离 分析较为困难 致使其应用受到一定程度的限制 据统计只有大约20 的有机物能用气相色谱分析 液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制 它非常适合分子量较大 难气化 不易挥发或对热敏感的物质 离子型化合物及高聚物的分离分析 大约占有机物的70 80 液相色谱与气相色谱的比较 1 应用范围不同 因为 气相色谱的流动相载气是色谱惰性的 不参与分配平衡过程 与样品分子无亲和作用 样品分子只与固定相相互作用 而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子 为提高选择性增加了一个因素 也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相 增大分离的选择性 液相色谱与气相色谱的比较 2 液相色谱能完成难度较高的分离工作 液相色谱固定相类型多 如离子交换色谱和排阻色谱等 作为分析时选择余地大 而气相色谱并不可能的 液相色谱通常在室温下操作 较低的温度 一般有利于色谱分离条件的选择 液相色谱与气相色谱的比较 3 由于液体的扩散系数比气体的小105倍 因此 溶质在液相中的传质速率慢 柱外效应就显得特别重要 而在气相色谱中 柱外区域扩张可以忽略不计 4 液相色谱中制备样品简单 回收样品也比较容易 而且回收是定量的 适合于大量制备 液相色谱尚缺乏通用的检测器 仪器比较复杂 价格昂贵 在实际应用中 这两种色谱技术是互相补充的 液相色谱与气相色谱的比较 综上所述 高效液相色谱法具有高柱效 高选择性 分析速度快 灵敏度高 重复性好 应用范围广等优点 该法已成为现代分析技术的重要手段之一 目前在化学 化工 医药 生化 环保 农业等科学领域获得广泛的应用 17 2高效液相色谱仪 高效液相色谱仪一般可分为4个主要部分 高压输液系统 进样系统 分离系统和检测系统 此外还配有辅助装置 如梯度淋洗 自动进样及数据处理等 其工作过程如下 首先高压泵将贮液器中流动相经过进样器送入色谱柱 然后从控制器的出口流出 当注入待分离的样品时 流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离 然后依先后顺序进入检测器 记录仪将检测器送出的信号记录下来 由此得到液相色谱图 高压输液系统 进样系统 分离系统和检测系统 高压输液系统 进样系统 分离系统和检测系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细 因此对流动相阻力很大 为使流动相较快流动 必须配备有高压输液系统 它是仪器最重要的部件 由储液罐 高压输液泵 过滤器 压力脉动阻力器等组成 对高压输液泵的要求 密封性好 输出流量恒定 压力平稳 可调范围宽 便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求 一 高压输液系统 常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种 恒流泵特点是在一定操作条件下 输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关 恒压泵是指能保持输出压力恒定 但其流量则随色谱系统阻力而变化 故保留时间的重现性差 它们各有优缺点 目前恒流泵比恒压泵优越 使用较普遍 恒流泵分机械注射泵和机械往复泵 两种 高压输液泵 主要部件之一 压力 150 450 105Pa 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相 10 m 液体的流动相高速通过时 将产生很高的压力 因此高压 高速是高效液相色谱的特点之一 二 进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多 约5 30cm 所以柱外展宽 又称柱外效应 较突出 柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽 主要包括进样系统 连接管道及检测器中存在死体积 进样系统是引起柱前展宽的主要因素 因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严 流路中为高压力工作状态 通常使用耐高压的六通阀进样装置 其结构如图所示 准备状态 进样状态 流动相入口 色谱柱入口 样品出口 样品入口 流动相入口 色谱柱入口 样品环 三 分离系统 色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件 它包括柱管与固定相两部分 柱管材料有玻璃 不锈钢 铝 铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属 玻璃管耐压有限 故金属管用得较多 一般色谱柱长5 30cm 内径为4 5mm 一般在分离前备有一个前置柱 前置柱内填充物和分离柱完全一样 这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和 使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相 保证分离技术的性能不受影响 柱子装填得好坏对柱效影响很大 对于细粒度的填料 20 m 一般采用匀浆填充法装柱 先将填料调成匀浆 然后在高压泵作用下 快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内 经冲洗后 即可备用 对色谱柱的要求 柱效高 选择性好 分析速度快等 使用色谱柱注意事项 1溶剂要脱气 溶剂和样品应过滤 防止堵塞 2加前置柱 3更换流动相要渐变 4用后要保护好 四 检测系统 HPLC与GC一样 要求检测器灵敏度高 重现性好 定量准确 对温度和流速的变化不敏感 应用范围广 线性范围宽等优点检测器分为两大类 一类是溶质性检测器 它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应 属于这类检测器的有紫外 荧光 电化学检测器等 另一类是总体检测器 它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应 属于这类检测器的有示差折光 电导检测器等 现将常用的检测器介绍如下 HPLC中应用最广泛的检测器 它的原理基于待测组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收 试样浓度与吸光度的关系服从朗伯 比尔定律 高效液相色谱检测器 1 紫外光度检测器 UV 优点 灵敏度高 选择性好 对流量和温度的变化不敏感 适用于梯度淋洗 线性范围宽 适用于痕量分析 最小检测量10 9g mL 1 缺点 只适用于检测能吸收紫外 可见光的物质 流动相选择受限制 要求流动相在测定波长下无吸收 2 示差折光率检测器 检测器是一种通用型检测器 它的作用原理是纯流动相与包含样品的流动相之间的折射率不同 检测器把这种差值检测出来 给出信号 信号的大小与样品含量成正比 纯流动相与待测组分的折射率相差越大 检测器灵敏度越高 灵敏度可达10 7g cm 3 通用性强 不破坏样品 线性范围宽 缺点是灵敏度低 不适宜痕量分析 对温度变化敏感 并且不能用于梯度淋洗 3 荧光检测器4 蒸发光散射检测器5 电化学检测器6 质谱检测器 它包括脱气 梯度淋洗 恒温 自动进样 馏分收集以及数据处理等装置 其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置 HPLC梯度淋洗与GC中的程序升温一样 对于某些复杂样品 组分的k 范围很宽 用一种强度的溶剂淋洗时不能得到很好的分离 采用梯度淋洗 就是组成流动相的两种或两种以上不同的溶剂按一定程序改变配比 极性 pH 离子强度 通过流动相极性的变化来改变待分离样品的选择因子和tR 从而提高分离效果和分析速度 5 附属系统 外梯度 利用两台高压输液泵 将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室 混合后进入色谱柱 内梯度 一台高压泵 通过比例调节阀 将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合 和气相色谱一样 液相色谱分离系统也由两相 固定相和流动相组成 液相色谱的固定相可以是吸附剂 化学键合固定相 或在惰性载体表面涂上一层液膜 离子交换树脂或多孔性凝胶 流动相是各种溶剂 被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱 根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力 分配系数 离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离 液相色谱分离原理及分类 17 3高效液相色谱的类型 液相色谱分离的实质是样品分子 以下称溶质 与溶剂 即流动相或洗脱液 以及固定相分子间的作用 作用力的大小 决定色谱过程的保留行为 根据分离机制不同 液相色谱可分为 液固吸附色谱 液液分配色谱 化学键合色谱 离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型 一 液 固吸附色谱法 LSAC 液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相 吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质 在它们的表面存在吸附中心 液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的 1 分离原理当流动相通过固定相 吸附剂 时 吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子 同时 当试样分子 X 被流动相带入柱内 与流动相溶剂分子 S 在固定相表面发生竞争吸附 X nS吸附 X吸附 nS X nS吸附 X吸附 nS达平衡时 有 其中K为吸附平衡常数 K值大表示组分在吸附剂上保留强 难于洗脱 K值小 则保留值弱 易于洗脱 试样中各组分据此得以分离 K值可通过吸附等温线数据求出 2 固定相 吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂 如硅胶 氧化铝 聚酸胶等 由于硅胶的优点较多 因此 以硅胶用得最多 在高效液相色谱法中 表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相 目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料 3 流动相 一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂 在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂 对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂 二 液 液分配色谱 LLPC 在液 液色谱中 流动相和固定相都是液体 它能适用于各种样品类型的分离和分析 无论是极性的和非极性的 水溶性和油溶性的 离子型的和非离子型的化合物 1 分离原理液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同 都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同 具有不同的分配系数 所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的 使这种分配平衡可反复多次进行 造成各组分的差速迁移 提高了分离效率 从而能分离各种复杂组分 2 固定相由于液液色谱中流动相参与选择竞争 因此 对固定相选择较简单 只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题 例如 最常用的强极性固定液 一氧二丙腈 中等极性的聚乙二醇 非极性的角鲨烷等 为了更好解决固定液在载体上流失问题 产生了化学键合固定相 它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法 它代替了固定液的机械涂渍 因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用 可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破 它是目前应用最广泛的一种固定相 据统计 约有3 4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的 3 流动相在液液色谱中为了避免固定液的流失 对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶 而且流动相与固定相的极性差别越显著越好 根据所使用的流动相和固定相的极性程度 将其分为正相分配色谱和反相分配色谱 如果采用流动相的极性小于固定相的极性 称为正相分配色谱 它适用于极性化合物的分离 其流出顺序是极性小的先流出 极性大的后流出 如果采用流动相的极性大于固定相的极性 称为反相分配色谱 它适用于非极性化合物的分离 其流出顺序与正相色谱恰好相反 三 化学键合相色谱 CBPC 采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法 简称键合相色谱 由于键合固定相非常稳定 在使用中不易流失 适用于梯度淋洗 特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品 由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的 因此它适用于种类繁多样品的分离 1 键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体 几乎都用硅胶 利用硅胶表面的硅醇基 Si一OH 与有机分子可成键 即可得到各种性能的固定相 一般可分三类 1 疏水基团如不同链长的烷烃 C8和C18 和苯基等 2 极性基团如氨丙基 氰基 醚和醇等 3 离子交换基团如作为阴离子交换基团的胺基 季胺盐 作为阳离子交换基团的磺酸基等 2 反相键合相色谱法 此法的固定相是采用极性较小的键合固定相 如硅胶 C18H37 硅胶 苯基等 流动相是采用极性较强的溶剂 如甲醇 水 乙腈 水 水和无机盐的缓冲溶液等 它多用于分离多环芳烃等低极性化合物 若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相 也可用于分离极性化合物 若采用水和无机盐的缓冲液为流动相 则可分离一些易离解的样品 如有机酸 有机碱 酚类等 反相键合相色谱法具有柱效高 能获得无拖尾色谱峰的优点 3 正相键合相色谱法 此法是以极性的有机基团 CN NH2双羟基等键合在硅胶表面作为固定相 而以非极性或极性小的溶剂 如烃类 中加入适量的极性溶剂 如氯仿 醇 乙腈等 为流动相 分离极性化合物 此时 组分的分配比k值随其极性的增加而增大 但随流动相极性的增加而降低 这种色谱方法主要用于分离异构体 极性不同的化合物 特别适用于分离不同类型的化合物 4 离子性键合相色谱 当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质 化学键合各种离子交换基团 如 SO3H CH2NH2 COOH等时 就形成了离子性键合相色谱的固定相 流动相一般采用缓冲溶液 其分离原理与离子交换色谱类同 以上讨论了各种类型化学键合相色谱法 归纳键合相色谱的最大优点是 通过改变流动相的组成和种类 可有效地分离各种类型化合物 非极性 极性和离子型 此外 由于键合到载体上的基团不易流失 特别适用于梯度淋洗 据统计 在高效液相色谱法中 约有8O 的分离问题是用键合相色谱法解决 此法的最大缺点是不能用于酸 碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系 四 离子交换色谱法 IEC 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法 凡在溶液中能够电离的物质 通常都可用离子交换色谱法进行分离 它不仅适用无机离子混合物的分离 亦可用于有机物的分离 例如氨基酸 核酸 蛋白质等生物大分子 因此 应用范围较广 1 离子交换原理离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的 其固定相采用离子交换树脂 树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子 当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换 其交换反应通式如下 阳离子交换 阴离子交换 一般形式 R A B R B A 2 固定相作为固定相的离子交换剂 其基质大致有三大类 合成树脂 聚苯乙烯 纤维素和硅胶 而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分 再根据官能基的离解度大小还有强弱之分 见下表 3 流动相 离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度 或离子强度 水的缓冲溶液 通过改变流动相中盐离子的种类 浓度和pH值可控制k值 改变选择性 如果增加盐离子的浓度 则可降低样品离子的竞争吸附能力 从而降低其在固定相上的保留值 关于pH值的影响 要视不同情况而定 例如 分离有机酸和有机碱时 这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制 增大pH值会使酸的电离度增加 使碱的电离度减少 降低PH值 其结果相反 但无论属于哪种情况 只要电离度增大 就会使样品的保留增大 五 离子色谱 IC 反相色谱中 在极性流动相中加入离子对试剂 使被测组分与其中的反离子形成中性离子对 增加k和tR 以改善分离 1 离子对试剂 烷基磺酸钠 分析碱四丁基季胺盐 分析酸2 影响k的因素a 与m的极性有关 同反相色谱 b 与R的链长有关 R 长 极性 小 tR k 3 适用 较强的有机酸 碱 1 反相离子对色谱法 IPC或PIC 2 反相离子抑制色谱 在反相色谱中 通过加入缓冲溶液调节流动相pH值 抑制组分解离 增加其k和tR 以达到改善分离的目的 1 离子抑制剂 弱酸 弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液 2 k的影响因素 与流动相极性有关 还与pH值有关选择流动相 应同时考虑极性及pH值酸性物质 加入酸HActR k 碱性物质 加入碱NH3 H2OtR k 调节pH范围 3 0 8 0pH 8 0破坏键合相与载体的结合pH 3 0腐蚀柱子3 适用 极弱酸碱物质pH 3 7弱酸 pH 7 8弱碱 两性化合物 3 对流动相的要求 1 与固定液不反应2 对样品有良好溶解度k 1 10k 2 5最理想的3 与检测器匹配 UV 常用 测定波长应大于溶剂的截止波长 荧光 电化学4 使用粘度小 纯度高的流动相 甲醇 乙腈 使用前过滤 脱气 4 洗脱方式 1 等度洗脱 恒组成溶剂洗脱 以固定配比的溶剂系统洗脱组分 一个泵 类似GC的等温度洗脱2 梯度洗脱 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性 两个泵 适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温 沸程较长样品 六 凝胶色谱法 SEC 凝胶色谱法又称尺寸排阻色谱法 主要用于较大分子的分离 与其他液相色谱方法原理不同 它不具有吸附 分配和离子交换作用机理 而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的 尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级 即用来分析大分子物质相对分子质量的分布 它具有其他液相色谱所没有的特点 1 保留时间是分子尺寸的函数 有可能提供分子结构的某些信息 2 保留时间短 谱峰窄 易检测 可采用灵敏度较低的检测器 3 固定相与分