《医学第七组》PPT课件.ppt

生技大实验综合展示 第七组组员 1 单元一 目的基因的提取2 单元二 目的基因的连接转化及重组子筛选3 单元三 重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达4 单元四 重组蛋白的分离纯化及检测 实验内容 实验原理 1 总RNA的提取 RNA的提取一般是用强变性剂使蛋白质和DNA变性 利用有机溶剂抽提去掉蛋白质 多糖等 最后在RNA沉淀剂的作用下 分离出RNA 2 琼脂糖凝胶电泳 核酸分子带负电 在电场中向正极移动 核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时 主要具有分子筛效应 3 逆转录PCR 单元一 目的基因的提取 实验结果 1 紫外分光光度法测定RNA浓度 1 A260 A280 1 8 2 0最佳2 C ug ml A260 40 稀释倍数 3个样本的RNA纯度较高 实验过程未出现污染 均在2000ng L以上且分布较为均匀 说明RNA的提取较为充分 且研磨后样本的分装较为平均 电泳检测RNA完整性 1 三条明显的亮带2 28S和18SrRNA处为明显的亮带 5SrRNA带的亮度则较弱3 28S 18S约为2 1 RT PCR琼脂糖凝胶电泳 一条明显的亮带组成 与Marker对比后可得产物的大小约为500bp 与目标相符 单元二 目的基因的连接 转化及重组子筛选 实验内容 1 cDNA的TA克隆2 重组质粒转化大肠杆菌3 质粒酶切鉴定插入片段 实验原理 1 TA克隆 2 感受态细胞制备 质粒转化 3 蓝白斑筛选 胶回收DNA 感受态细胞制备 测OD 筛选2号DNA 正 负 感受态细胞 vector solution TA克隆 vector 转化 蓝白斑筛选 实验步骤 随机挑选1 2 3 4号白色阳性菌落 进行菌落PCR鉴定 随机挑选上述过夜培养的1 2号菌落 进行双酶切鉴定 双酶切鉴定 菌液 Solution EDTA RNaseA Solution NaOH Solution 中和 1 提取质粒 2 双酶切 10 Buffer KpnI XbalI 灭菌水 灭火 65 水浴中10min 3 电泳 琼脂糖凝胶电泳 结果 实验结果 1 蓝白斑筛选 LB Amp IPTG X Gal平板 空载质粒的摩尔数 3 10 15mol插入DNA片段的摩尔数 1 933 10 12mol空载质粒的摩尔数 插入DNA片段的摩尔数 1 1000 该比值远小于1 2到1 10的范围 待插入DNA片段过多 当时未稀释待插入DNA 直接进行了转化实验 导致实验组和对照组菌落密度偏大 空载质粒转化效率计算如下 1 l5ng l即5ng的质粒加入2号100 l感受态细胞EP管中 取50 l加LB Amp IPTG X Gal平板 最后加入玻璃珠 摇动混匀涂布平板 第二天记录蓝色菌落共计6000 此时转化效率 6000cfu 5ng 2 4 103cfu ng 2 4 106cfu g质粒 2 菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳 Marker1234bp20001000750500250100 3 KpnI XbaI双酶切琼脂糖凝胶电泳示意图 Marker12bp20001000750500250100 单元三 重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达 实验原理 乳糖操纵子的调控机制 实验流程 1 2 3 4 菌体活化 放大 诱导 收菌 紫外灯观察 超破 紫外灯下 UV365nm 1 5 管观察结果 实验结果 实验结果分析 1 为阴性对照组 所用工程菌并不含有GFP序列 故不能表达荧光蛋白 紫外灯下无荧光 2 未加入IPTG和葡萄糖 但其培养基中含有乳糖 故2 中存在异构乳糖的诱导效应 不存在葡萄糖降解物阻遏效应 又因乳糖含量较低 2 出现微弱的荧光 3 培养过程中同时加入了IPTG和葡萄糖 故大肠杆菌细胞优先利用葡萄糖 GFP的表达被抑制 无荧光 4 培养中加入了IPTG 无葡萄糖 IPTG持久诱导GFP的表达产生大量的绿色荧光蛋白 故4 发出非常明显的荧光 5 为4 第三次离心的上清液 无荧光 原因是实验中采用原核细胞表达系统 外源基因的表达产物往往在胞浆中聚集形成均一密度的包涵体 三次离心后细胞沉在底部 上清液中没有或极少细胞 故无荧光 单元四 重组蛋白的分离纯化及检测 实验原理 1 亲和层析 以普通凝胶作载体 连接上金属离子制成螯合吸附剂 用于分离纯化蛋白质 这种方法称为金属螯合亲和层析 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 由丙稀酰胺单体 acrylamide 和交联试剂N N 甲叉双丙稀酰胺 N N methylenebisacrylamide 在催化剂存在的情况下聚合而成的三维网状结构的凝胶 改变单体的浓度与交联剂的比例 可以得到不同孔径大小的凝胶 本实验采用化学聚合法制胶 进行不连续电泳 并用考马斯亮蓝快速染色 以分离和鉴定纯化的蛋白产物 3 westernblot 蛋白质样品经SDS PAGE电泳后 凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移 固定到载体 如尼龙膜 硝酸纤维素膜 PVDF膜 上 然后以膜上的蛋白或多肽为抗原 与相应的第一抗体和酶标记的第二抗体反应 用适当的溶液漂洗去未结合抗体后 置含底物的溶液中培育 显出谱带 即可检测出样品中的特异组分 PAGE胶配置 保存 每组配两块 Western blot检测 10月31日 10月31日 亲和层析 SDS PAGE SDS PAGE 转移 封闭 1抗过夜 2抗 显色 11月1日 11月2日 染色 脱色过夜 观察结果 拍照 配置western blot用试剂 实验流程 1 亲和层析 加缓冲液 加50mmol L咪唑 加300mmol L咪唑 第一 二个峰是没能结合到柱子上的杂蛋白质 第三个峰为虽然结合到柱子上 但是结合不紧密的杂蛋白 第四个峰为我们需要的目标蛋白 绿色荧光蛋白 实验结果 2 SDS PAGE凝胶电泳 1701309572554334261710 pGFP未诱导 M pGFP加Glu及IPTG pGFP加IPTG诱导 离心上清 层析穿流峰 50mM咪唑洗脱 300mM咪唑洗脱 KD 从上图可以看出 marker条带位于最左端 marker泳道中10KD和17KD两条带几乎重合 但还是可以看出上面的蓝色及下方的绿色条带 7号泳道GFP条带最深最宽 位于26 34KD左右 该结果与其约27KD的分子量相符 其条带又深又宽 与其经过300mM咪唑洗脱纯化的实验过程相符 6号泳道为经50mM咪唑洗脱 可以看出许多其他条带及隐约的一条GFP条带 证明有少量GFP被洗脱 5号泳道为杂蛋白 为层析时的穿流峰 含有许多不同分子量的条带 但不含GFP 4号泳道为离心上清 由于超破后离心 上清中含有许多蛋白 包括GFP 因而电泳结果中不仅含杂蛋白 也含GFP 1 2 3号泳道分别为重组大肠杆菌GFP的本底水平表达 葡萄糖降解物阻遏效应后的表达及诱导表达 因而只有3号泳道有GFP的出现 当然 1 2 3号泳道还有其他杂蛋白的表达 上图中可以看出几条隐约出现的细细的条带 3 Western Blot 1701309572554334261710 M12 1号泳道是离心上清 2号泳道是300mM咪唑洗脱蛋白 50mM咪唑洗脱蛋白和穿流峰洗脱蛋白被不幸剪掉 可以明显看到目标蛋白 在26KD和34KD之间 从上图可以看出 剪膜时出现差错 将3 4号泳道剪掉 原因是marker并非点在最左端 为方便标记分子量图中未画出PVDF膜左侧的膜 因而剪膜时对点样在marker左侧还是右侧判断失误 当时以为点样在左侧 结果将右侧PVDF膜剪掉 因而错失了3 4泳道的条带 从上图中只可以看出marker 1号泳道全部条带及2号泳道部分条带 marker泳道中10KD和17KD两条带几乎重合 但还是可以看出上面的蓝色及下方的绿色条带 1号泳道鉴定的是离心上清中的可溶蛋白 可以看出只含GFP一条带 约在26 34KD之间 与其实际分子量27KD相符 由于离心上清中有许多其他蛋白 而蛋白印迹只有一条带 证明一抗特异性十分好 二抗结合能力也较好 2号泳道为用300mM