第五章原生质体培养.ppt

第五章原生质体培养 一 原生质体的制备 基础材料准备预处理与酶解原生质体收集与纯化原生质体活力测定 1 用于分离原生质体材料的准备 无菌试管苗叶片 培养细胞 2 预处理与酶解 材料预处理 子叶 下胚轴 叶片 愈伤组织或胚性悬浮细胞 叶肉原生质体 原生质体分离常用的商品酶酶来源生产厂家纤维素酶类onozukaR 10绿色木霉YakultHonshaCo Ltd Tokyo JapanCellulysin绿色木霉Calbiochem SanDiego CA92037 USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo Tokyo Japan果胶酶类MacerozymeR 10根霉YakyltHonshaCo Ltd Tokyo JapanPectinase黑曲霉SigmaChemicalCo St Louit MO63178 USAPectolyaseY 23黑曲霉SeishinPharm Co Ltd Tokyo Japan半纤维素酶RhozymeHP 150黑曲酶RohmandHassCo Philadelphia PA19105 USAHemicellulase黑曲霉SigmaChemicalCo St Louis MO63178 USA 酶溶剂及其渗透压酶溶剂 原生质体培养基或特殊配制 渗透压调节剂 葡萄糖 甘露醇 山梨醇等 酶处理 酶浓度酶解时间酶解温度 3 原生质体的收集和纯化 飘浮法 常用的飘浮剂 蔗糖 Percoll Ficoll 沉淀法 常用甘露醇作为渗透压调节剂 先将酶液洗出干净 再用Percoll飘浮一次 建立细胞悬浮系 叶肉原生质体分离纯化 Purifiedprotoplasts Leaveswerecutinthinstripesanddigestedinanenzymesolutionwithmannitol Purificationofprotoplastsfromleafdebrisonsucrosegradient 4 原生质体活力检测 目测法 在显微镜下观察 根据细胞形态 流动性确定原生质体活力 FDA法 FDA 二乙酸荧光素 是一种非极性物质 能自由地穿越细胞质膜 在活细胞内 FDA被酯酶裂解即发荧光 荧光素 由于荧光素不能自由通过质膜 因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性 伊凡蓝法 伊凡蓝不能穿过质膜 只有质膜受到严重损坏使 细胞才能被染色 因而可以通过细胞被染色与否确定活性 5 影响原生质体活力的因素分离材料的生理状态酶解条件 酶质量 浓度 酶解温度 酶解时间 酶溶液的渗透压分离条件 离心次数 离心速度 纯化方法 分离持续时间环境条件 操作环境的温度 分离用具的影响 二 原生质体培养 1 原生质体培养基无机盐 大量元素浓度 NO3 和NH4 的比例 Ca2 浓度有机成分 维生素 氨基酸 糖及糖醇等 酵母提取物 水解酪蛋白 激素 常用的激素 NAA IAA BA与2 4 D渗透压 常用的渗透压调节剂 甘露醇 山梨醇 蔗糖和葡萄糖等 原生质体的渗透压原则 培养基渗透压与细胞渗透压等渗 2 原生质体培养方法 液体浅层培养将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层 封口后进行培养 优点 操作简单 对原生质体的损伤小 且易于添加新鲜培养基转移培养物 缺点 原生质体分布不均匀 常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育 此外 难以跟踪观察某一个细胞的发育情况 液体 固体双层培养在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基 再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面 优点 固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体培养基中 如果在下层固体培养基中加一定量的活性炭 则还可以吸附培养物产生的一些有害物质 促进原生质体的分裂和细胞团的形成 缺点 不易观察细胞的发育过程 固体平板培养即琼脂糖包埋培养 低融点的琼脂糖可在约30 融化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动 混合后含有原生质体的培养基铺于培养皿底部 封口后进行培养 优点 可以跟踪观察单个原生质体的发育情况 易于统计原生质体分裂频率 缺点 操作要求严格 尤其是混合时的温度掌握必需合适 温度偏高则影响原生质体的活力 温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀 琼脂糖珠培养将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ul一滴的量滴于直径6cm的培养皿 待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养 培养过程中 通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育 这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境 从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成 3 原生质体发育和植株再生 细胞壁再生细胞分裂与生长愈伤组织形成植株再生 细胞壁的再生原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁 一至数天内便可形成完整的细胞壁 电镜观察发现 原生质体培养数小时后新壁开始形成 先是质膜合成形成细胞壁主要成分的微纤维 然后转移到质膜表面进行聚合作用产生多片层的结构 以后在质膜与片层之间或在膜上产生小纤维丝 逐渐形成不定向的纤维团 最后形成完整的细胞壁 细胞分裂和生长 一般原生质体培养2 7d后开始第一次分裂 但开始第一次分裂的时间随植物的种类 分离原生质体的材料 原生质体的质量 培养基的成分和培养条件而异 一般用幼苗的下胚轴 子叶 幼根 悬浮培养细胞 未成熟种子子叶等为材料分离的原生质体 比用叶分离的原生质体容易诱导分裂 第一次分裂出现的时间较快 愈伤组织形成 通常原生质体培养2周后 形成多细胞的细胞团 3周后形成肉眼可见的小细胞团 约6周后形成直径1mm的小愈伤组织 原生质体培养7 10d后需及时添加新鲜培养基 否则形成的细胞团不继续生长 待小愈伤组织长至约1mm时应及时转移到固体培养基上使其进一步生长 植株再生 原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化培养基上可一步成苗 但越来越多的试验证明 两步成苗法更适合大多数植物原生质体再生植株 即 首先将愈伤组织培养于含低浓度生长素培养基上 让其增殖和调整状态 再将其转移到分化培养基上分化成苗 Protoplastcultureandfertilegreenplantregenerationofrye aFriableembryogeniccalli bsuspensioncellaggregates cfreshlyisolatedprotoplastsfromsuspensionculture dprotoplastsstainedwithFDA edivisionofcellderivedfromprotoplasts fcellcoloniesderivedfromprotoplast gproto callidevelopedfromprotoplastsembeddedinagarose hgreenshootformation ifertilegreenplant a firstdivision 10daysafterprotoplastisolationb c 2and3womicrocolonies d e 4and6womicrocallif 8womicrocallijustbeforebeingtransferredontoB5hmedium a b c d e f i h g Recoveryofplantletsthroughsomaticembryogenesis g TransferofmicrocalliontoB5Hmediumandinductionofsoma