核酸检测篇4-Real-Time PCR.docx

编号：2-5主题：Real-Time PCR概述：Real-Time PCR 技术，又称实时定量荧光PCR(real-time quantitative PCR)，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。Real-Time PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。常用方法：SYBR green（荧光染料掺入法） 和Taqman probe （探针法）。目的：用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。原理：1.SYBR green（非特异性荧光标记）:在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。2.Taqman Probe（特异性荧光标记）:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。步骤：1. RNA抽提（以细胞样品为例，操作步骤同RT-PCR）1.1弃去培液，PBS洗2遍，加入1ml Trizol，轻轻吹打，直至细胞脱落，吸入1.5 ml EP管内，静置5 min。（Trizol量根据细胞密度可适当调整，建议：6孔板细胞长满1ml Trizol）1.2 加入200l氯仿（三氯甲烷），用手剧烈震荡15秒，室温静置2-3分钟。（氯仿量为1/5 Trizol）1.3 12000g，4，离心15min。1.4 仔细转移上层水相到1个新EP管中，不能贪多，约400-500l。1.5加等体积异丙醇，轻柔混合45次，室温放置10分钟。1.6 12000g，4，离心10min。1.7轻轻倒去上清，用20 l枪轻轻吸去残液，沉淀用1ml 75%乙醇（0.75ml无水乙醇0.25ml DEPC水，现配）洗12次，涡旋混匀。1.8吸去上清，5-10分钟空气干燥RNA。（肉眼不能明显看到水分即可）1.9加15-20l DEPC水，吹打数次，测浓度。注释：mRNA不稳定，很容易讲解，因此mRNA提取过程中要尽量避免RNA酶污染。2. 反转录（参照商品化试剂盒说明书）3. 定量PCR实验（具体参数设置请参照商品化试剂盒说明书）（1）PCR reaction mix的制备 (在冰上操作)；（2）将8联管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部；（3）PCR 反应，采用了标准的三步法程序进行反应（4）在PCR 反应后，进行熔解曲