时间分辨荧光免疫分析方法的光谱研究解读.doc

第24卷, 第5期光谱学与光谱分析2004年5月Spectroscopy and S pectral Analysis Vol 124,No 15,pp5962599May , 2004时间分辨荧光免疫分析方法的光谱研究郭周义, 田振, 贾雅丽华南师范大学激光生命科学研究所, 广东广州510631摘要时间分辨荧光免疫分析法是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物, 标记蛋白质、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞, 待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲合反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等 发生后, 用时间分辨荧光技术测定反应体系中分析物的浓度, 的。它之所以能够继放射性同位素标记、酶标记、化学发光、更灵敏的检测方法, 3+命荧光团Eu 螯合物的光谱研究结果, :336337nm3+的激发波长, 有利于Eu 主题词免疫分析; ; Eu 3+螯合物中图分类号:A文章编号:100020593(2004 0520596204111f f 跃迁光谱引言最近几年发展起来的时间分辨荧光免疫分析方法(TR 2FIA 是超微量免疫检定法的一大突破。由于使用了时间分辨光谱技术和荧光增强技术, 使荧光免疫分析的灵敏度得到了极大提高。1983年Petterson 1和Eskola 2首先将时间分辨荧光光谱技术应用于免疫分析的研究中。目前, TRFIA 的最低检出值已达10-19mol well -1, 远远超过酶标记免疫分析法(EIA 的10-9mol well -1, 放射免疫分析法(RIA 的10-15mol well -1和发光免疫分析法(L IA 的10-15mol L -1。稀土离子是金属离子, 若用来直接标记抗原、抗体, 标记率很低, 一般使用含有双功能基团的螯合剂, 形成稀土离子2螯合剂2抗原(或抗体 的螯合物。稀土离子的荧光, 不仅与自身的能级结构有关, 而且与螯合剂的性质有关。螯合物不同, 稀土离子的激发光和发射光也会有所不同。指f n 组态内, 不同J 能级间跃迁所产生的光谱。它的特点是:(1 发光弱。这主要是因为f f 跃迁是宇称选择规则禁1稀土离子的吸收光谱镧系离子的电子排布为21s 2s 22p 63s 23p 63d 104s 24p 64d 104f n 5s 25p 6(n =014 , 其主要价态有二价、三价和四价。三价态是特征氧化态, 其n基组态是4f (n =014 , 下一个激发态是4f n -15d 3。稀土离子吸收光谱4的产生可归因于三种情况。收稿日期:2003203226, 修订日期:2003206228阻的。虽然在溶液和固态化合物中, 由于配体场微扰, 也能观察到相应的光谱, 但相对于d d 跃迁来说, 也是相当弱的。(2 类线性的光谱。谱带的尖锐原因是处于内层的4f 电子受到5s 2, 5p 6电子的屏蔽, 受环境的影响较小。(3 谱带的范围较广。在近紫外, 可见区和近红外区内的光谱。都能得到稀土离子(112f d 跃迁光谱4f n 向4f n -15d 的跃迁是组态间的跃迁。这种跃迁是宇称选择规则允许的, 因而4f 5d 的跃迁是较强的; 三价离子的吸收带一般在紫外区出现; 由于5d 能级易受周围离子的配体场影响, 相对于f f 跃迁来说, 谱带变宽。113电荷跃迁光谱稀土离子的电荷跃迁光谱, 是指配体向金属发生电荷跃迁而产生的光谱, 是电荷密度从配体的分子轨道向金属离子轨道进行重新分配的结果。镧系络合物能否出现电荷跃迁带 取决于配体和金属离子的氧化还原性。一般在易氧化的配体3+3+和易还原为低价离子(Sm , Eu , Te 3+, Yb 3+和Ce 4+ 的络合物光谱中易见到电荷跃迁带。谱带的特点是有较强的强度和较宽的宽度。基金项目:广东省科技攻关重点项目(2002C60113 ; 广州市天河区科技计划项目(2002XGP06 ; 广东省自然科学基金项目(No 1015012,No. 031518 ; 教育部科学技术研究重点项目(No 102113 资助作者简介:郭周义, 1965年生, 华南师范大学激光生命科学研究所教授, 博士生导师 301, 23415, 292, 189nm 。2稀土离子的荧光性能211稀土的荧光光谱在紫外线等高能射线的激发下, 处在溶液或化合物中的三价稀土离子被激发, 从基态跃迁到激发态, 然后再从激发态返回到能量较低的能态时, 放出辐射能而发光, 这种光即为荧光。稀土离子的荧光光谱也像吸收光谱一样, 来自三个方面的跃迁:f f 跃迁; 5d 4f 跃迁; 电荷转移跃迁。当一些络合物的配体不吸收紫外光时, 其荧光的产生, 可通过电荷跃迁或4f n -4f n -15d 跃迁至相应的激发态, 再以非辐射衰变至4f n 组态的激发态, 此激发态向低能态跃迁时, 也可产生荧光。212紫外线激发产生荧光的物理过程4络合物荧光的能量跃迁过程, 一般可分三步来说明(跃迁过程见图1 :(1 先由配体吸收辐射能, 从单重态的基态S 0跃迁至激发态S 1, 其激发能可以辐射方式回到基态S 体荧光 , 或T 2; (2 , 态(磷光 , 图中是稀土离子 ; (3 的能量跃迁也有两种方式, , 再至基态, 或以辐射方式跃迁到较低能态, 此时就产生荧光 。Fig 12Charge 2transfer transition spectrum of Eu 3+halide(1 Eucl 6-3; (EuBr 6-3335D 07F J 的跃迁光谱, 包括电荷转。电荷转移跃迁光谱是配体向稀土离子的电荷转移态(4f 壳层内 发生电荷转移而产生的, 5D 07F 1, 7F 2, 7F 4的荧光波长分别为590596nm ,610620nm , 687703nm 。而当用2二酮体作Eu 3+配位体时, 与电荷转移跃迁不同, 配位体的三重态与Eu 3+的5D J 态发生共振能量转移, 而不是电子密度的重新分配。Eu 3+依靠配位二酮体的能量转移, 可以得到强烈的Eu 3+的5D 07F 2(610620nm 跃迁荧光。我们的实验表明, 依靠配体的能量转移获得的Eu 3+的5D 07F 2荧光强度远远大于由于电荷转移或4f 5d 的跃迁吸收所得到的5D 07F 2的荧光强度。4TRFIA 中Eu 3+螯合物的光谱我们在研究TRFIA 方法的过程中, 分别观察了标记化合物中, 以及添加增强液后溶液中形成的Eu 3+螯合物的吸收及荧光谱。这两种螯合物的吸收带均在紫外区。荧光增强Fig 11E nergy level scheme of the energy 2lossprocedure of the excited state从这里得知, 稀土离子长寿命荧光的产生, 是先由配体吸收能量, 然后以非辐射方式, 经三重态, 传递给稀土离子, 将稀土离子从基态跃迁到激发态, 接着, 处在激发态的离子, 以辐射方式跃迁到低能态而发出荧光。所以, 要产生较强的荧光, 选择合适的配体非常重要。一般来说, 当稀土离子的激发态与配体的三重态相当, 或在其以下时, 就可能由配体的三重态将能量转移给稀土离子, 产生长寿命荧光。经分析可知, 易氧化的配体与易还原的稀土离子组成的络合物, 易发生电荷转移跃迁。Eu 3+最易还原成Eu 2+。因3+此, 在Eu 的一些络合物的吸收谱中, 可经常出现电荷转移跃迁5(参见图2 。电荷跃迁带的出现与位置, 和配体性质3+-有关。Eu 的Cl , Br -, I -的络合物的电荷跃迁带分别位于Fig 13Absorption spectra of the fluorescent Eu 3+chelate(L 1C , Labelling chelate ; E 1L , Enhancement liquid Eu 3+螯合物的吸收在300350nm 区间表现出特殊的趋势(参见图3 。至少说明, 4f 组态被激发的机制是复杂的。(我们认为可能是依靠微弱的电荷转移或4f 5d 的吸收 , 而且标记化合物中Eu 3+的氧和氮的配位体不能起到转移激发能的作用 。我们注意到这一点, 是因为我们在实验中发现, 这段波长的激发与5D 07F 2的特征荧光峰的出现及强度有着直接关系, 说明此时的吸收及能量转移机制对Eu 3+的5D 0激发最为有利, 300350nm 是激发配位二酮体的最佳波段, 参见图4 。Fig 16Fluorescence spectra of the labeling chelateFig 14Fluorescence of the fluorescent Eu 3+chelate5TRFIA 的时间分辨技术及荧光增强技术的原理稀土螯合物经紫外激发后产生的荧光, 不但强度高, 而且荧光衰变时间也长, 大约101000s , 一般生物类样品的自然本底荧光的衰变时间只有几微秒, 荧光寿命的大的差异, 为采用时间分辨光谱技术提供了必要的条件。TRFIA 是时间分辨光谱技术与荧光增强技术和免疫分析技术的结合。分析的开始, 首先用Eu 3+螯合剂标记抗体(或抗原 , 要求螯合剂要有双功能基团, 一端螯合Eu 3+, 另一端螯合蛋白质。常用的螯合剂有:氨基苯基2EDTA , 异硫氰酸盐2EDTA , 12(P 2苯双氮 2EDTA , 它们保证了免疫分析的稳定性, 但是不能满足荧光检测的需要。选择既有强烈的螯合能力, 又有好的吸收及能量转移特性的螯合剂是十分困难的, 因此在TRFIA 方法中标记抗体和抗原与测量过程是分开进行的。为了满足检测需要, 在检测之前, 须向标记物中添加一种低p H 值的增强液, 其中包含2二酮体及32辛烷基磷化氢的氧化物等。溶液中会形成含二酮体配位体的Eu 3+螯合物。当选择合适的激发波长(336337nm 时, 二酮体能够被有效激发, 使Eu 3+发出5D 07F J (610620nm 的窄而强的特征荧光峰。1987年, Lehn 6发明了Eu 离子的一种穴状化合物, 由于这种穴状化合物很好地防止了水、氧及其他物质对铕离子荧光的猝灭效应, 且具有良好的亲合性, Lehn 和G erard Mathis 将它与X L665(一种稳定的allophycocyanin 分子 结合使用, 促进了快速时间分辨荧光技术的发展。铕离子与X L665之间通过共振能量转移的方式, 产生特征性的荧光, 且荧光产生的量子效率高, 促进了快速均相时间分辨荧光技术的发图4显示的是荧光增强Eu 3+螯合物的荧光谱。我们连续改变激发波长进行观察, 在336337nm 处得到了特征荧光峰(610620nm 的最大值, 即获得了最佳增强效果(见图5 。这主要是因为:336337nm 的波长有效地激发了配位二酮体的单态, 并且在能量转移过程中, 能级间的配合最为恰当 。Fig 15The highest effect of fluorescence enhancementby the fluorescent Eu 3+chelate当我们选用不同波长的光(300nm 激发标记化合物中的Eu 3+螯合物时(参见图6 , 发现Eu 3+的5D J 得到激发, 在荧光谱图上没有出现5D 07F J 的特征荧光峰, 直到波长改变到220280nm 时, 才发现了微弱的4f 组态的窄峰, 但几乎被强大的背景荧光所掩盖, 参见图6中第6条曲线。这 第5期光谱学与光谱分析599展。其作用示意图见图7。图7的上部分说明了此种铕离子螯合物的测量法。铕离子吸收337nm 的激发光后, 通过共振能量转移, 传给XL665, 发出665nm 的长寿命荧光, 经一段时间的延迟后, 再记录665nm 荧光的强度, 从而可消除短寿命背景荧光的干扰。图7的中间部分说明, 当XL665为自由状态或与铕离子离的较远时(一般有效距离不大于915nm 6, 它也发射665nm 的荧光, 但是荧光的衰变时间很短, 可通过时间延迟克服掉。图7的下部分说明, 当铕离子化合物未与XL665结合时, 其荧光为620nm 的长寿命的荧光, 通过波长分离与665nm 的荧光区别开来。6语, 也是20世纪末配基技术的重大进展, 测定、抗原到激素、药物, 十分广泛, 已引起国内外7, 8科学工作者的重视。参1Petterson K et al. Clin. Chem. , 1983, 29:60. 2Eskola J u et al. Clin. Chem. , 1983, 29:1777.3Michelsen B. Analysis and Application of Rare Earth Materials. Oslo :Universitetsforlaget , 1973.4ZHAN G Ruo 2hua (张若桦 . Lanthanide Chemistry (稀土元素化学 . Tianjin Pubhishing Company of Science and Technology (天津科学技术出Fig 17Principles of 考文献版社 , 1987.5Ryan J L. J. Phys. Chem. , 1966, 70:2845.6Dietrich B , Sauvage J 2P. The Nobel Award G oes to Crown Ethers , Cryptands and Other Host 3Guest Molecular Systems. New J. Chem. ,1987, 12:8.7TIAN Zhen , GUO Zhou 2yi et al (田振, 郭周义等 . Acta Laser Biology Sinica (激光生物学报 , 2002, 11(4 :290. 8TIAN Zhen , GUO Zhou 2yi (田振, 郭周义 . J. Optoelectronics Laser (光电子激光 , 2002, 13(11 :1998.Spectroscopic Evalu ation of Time 2R esolved FluoroimmunoassayGUO Zhou 2yi , TIAN Zhen , J IA Y a 2liInstitute of Laser Life Science , S outh China Normal University , Guangzhou 510631, ChinaAbstract The lanthanide trivalence ion and its chelates are used for markin g substance in Time 2Resolved Fluorescence Immunoassay(TRFIA , marking protein , hormone , antibody , nucleic acid probe or biologic alive cell , to measure the concentration of the analysis substance inside the reaction system with time 2resolved fluorometry after the reaction system occurred , and attain the quantitative analysis s purpose. TRFIA has therefore become a kind of new and more sensitive measurement method after radioisoto pe marking , enzymatic marking , chemiluminescence ,