剑麻H.11648组织培养快繁技术体系的建立.doc

剑麻H.11648组织培养快繁技术体系的建立黄麒参，陈玉生，洪向平，黄家总，钱兆军（广东省农垦南亚热带作物科技中心，广东广州510507）摘要：从外植体、基本培养基、激素水平及碳源的筛选方面进行H.11648麻组织培养快繁体系的建立研究。研究结果表明，珠芽苗茎尖为最理想的快速繁殖材料，芽诱导最佳培养基为MS+6-BA 5 mg/L+IBA 0.3 mg/L；继代增殖最适宜培养基为MMS+6-BA 5 mg/L+IBA 0.3 mg/L，增殖系数最高可达4.6；生根适宜培养基为1/2MMS+NAA 1.2 mg/L，生根率达到90%以上。将小苗移栽到农业土壤+泥碳土+沙（211）基质中，成活率达到95.5%。关键词：H.11648麻；外植体；组织培养；快速繁殖中图分类号：S563.8043文献标识码：A文章编号：1004-874X（2011）10-0026-03Establishment of tissue culture and rapid propagationtechnology of Agave sisalana H.11648HUANG Qi-shen，CHEN Yu-sheng，HONG Xiang-ping，HUANG Jia-zong，QIAN Zhao-jun(Guangdong Agribusiness South Aisa Tropical Crops Science and Technology Center，Guangzhou 510507，China)Abstract：By screening aspects of the explants,the basic medium,hormone levels and carbon,this experiment established the tissueculture micropropagation system of Agave sisalana H.11648.The results showed that the optimal explants material for rapid propagationwere bulbil shoot tip.The optimal shoot induction medium was MS+6-BA 5 mg/L+IBA 0.3 mg/L.The optimal subculture medium wasMMS+6-BA 5 mg/L+IBA 0.3 mg/L with the multiplication factor of up to 4.6.The optimal rooting medium was 1/2MMS+NAA 1.2 mg/L,therooting rate reached 90%.The rooted plantlets survied by 95.5%when transplanted onto containers for culture on the medium containingagricultural soil and peat and sand at ratio of 211.Key words：Agave sisalana H.11648；explants；tissue culture；rapid propagation剑麻（Agave sisalana）是我国热区重要的麻类经济作物，也是具有极大观赏价值的园艺作物。特别是在麻类作物利用方面，近年来剑麻产业发展迅速，成为我国具有广阔发展前景和较大出口潜力的热作优势产业。但由于品种退化，茎腐病和斑马纹病等病害严重等因素，使剑麻减产甚至整个热区剑麻产业倒退，而且剑麻一般采用母株钻心、腋芽繁殖种苗，易出现早花现象，影响剑麻的经济寿命。本试验主要是通过采用组织培养技术，进行剑麻无菌种苗的培育技术研究，为剑麻良种种苗的繁育与工厂化生产提供技术支持。1材料与方法1.1试验材料自广东省东方红农场高产麻田中，选取产量高、生长好、无病虫害的H.11648剑麻优良植株作为取材母株，从中选取钻心芽、珠芽苗、珠芽苗心叶、花穗枝梗作为外植体进行试验。1.2试验方法1.2.1外植体处理与筛选将选取的外植体用自来水冲洗干净，放于阴凉干燥处凉干2 d，剥去外叶，留下茎尖和心叶、枝梗作为接种材料。之后按下列程序进行消毒：75%酒精消毒1 min0.15%HgCl2溶液浸泡25 min无菌水冲洗35次无菌滤纸吸干。消毒处理后在超净工作台中把茎尖纵切成48块，心叶和枝梗纵切为2块，每块成12 cm的小段，各自接入基本培养基中（MMS+6-BA 5 mg/L+IBA 0.3 mg/L或N6+2,4-D 2 mg/L+6-BA 1 mg/L+IBA0.3 mg/L），寻找比较易还原出优质新生植株的外植体材料试验。培养条件为：光照强度1 0002 000 lx，每天光照10h，培养室温度保持在（253）。1.2.2培养基的筛选以MS、N6及改良MS（即改MS中的NH4NO3用量为400 mg/L，KH2PO4用量为400 mg/L、MgSO42H2O用量为500 mg/L，其他成分不变，以下简称MMS）为基本培养基，在其中添加种类及其浓度相同的生长调节物质、白砂糖50 g/L、琼脂粉8 g/L，pH=5.8，进行接种试验，寻找直接出芽效果最好的基本培养基。1.2.3激素水平的筛选试验集中对培养基中激素水平修改的探讨，以找出最适于剑麻组织培养增殖与生根培养的培养基激素浓度。以MMS为增殖培养基本培养基，附加不同浓度的6-BA及IBA，即采用6-BA 1、1.5、3、4.5、5、6.5、8 mg/L等7种水平与IBA 0.1、0.3、0.5 mg/L等3种水平正交，设计成21个组合；以1/2MMS为生根培养基本培养基，附加NAA 0.1、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mg/L等6种不同浓度水平，设计成6个组合进行一系列试验。1.2.4碳源种类的筛选在相同培养基条件下，分别采用相同重量（增殖50 g/L、生根20 g/L）的蔗糖、葡萄糖收稿日期：2011-03-31基金项目：广东省科技厅农业攻关项目（2010B020305003）作者简介：黄麒参（1964-），男，农艺师，E-mail：通讯作者：陈玉生（1979-），男，工程师，E-mail：图2丛生增殖培养IBA（mg/L）表4不同6-BA和IBA浓度组合对增殖系数的影响6-BA（mg/L）82.054.04.62.04.51.03.22.833.63.04.02.8出芽情况出芽少，单芽，有玻璃化正常芽少，单芽，芽弱直接分化正常丛生芽，芽多出芽率（%）20.016.653.3出芽数（个）6516外植体数（个）303030培养基表3不同基本培养基对芽分化的影响注：为MS+6-BA 5 mg/L+IBA 0.3 mg/L，为N6+6-BA 5mg/L+IBA 0.3 mg/L，为MMS+6-BA 5 mg/L+IBA 0.3 mg/L优质芽数（个）68300玻璃芽数（个）10000出芽数（个）168300接种数（瓶）30303030外植体钻心苗茎尖珠芽苗茎尖珠芽苗心叶花穗枝梗表1不同外植体在MMS+6-BA 5 mg/L+IBA 0.3 mg/L的诱导培养结果优质芽数（个）129125玻璃芽数（个）2358出芽数（个）359633诱导愈伤组织数（块）23252826接种数（瓶）30303030外植体钻心苗茎尖珠芽苗茎尖珠芽苗心叶花穗枝梗表2不同外植体在N6+2,4-D 2 mg/L+6-BA 1 mg/L+IBA 0.3 mg/L的诱导培养结果图1珠芽茎尖诱导培养不定芽及白砂糖作为培养基的碳源，进行增殖与生根培养试验。1.2.5生根苗移栽基质的筛选移栽前首先要把剑麻生根瓶苗搬放到室外，光线充足，散射光好，但不能有太阳直射光的地方，炼苗12 d左右，使苗木青绿，才开始移栽。移栽时将一定量生根植株从瓶中取出，用水洗净根部上的琼脂后，用1 000倍高锰酸钾溶液消毒25 min，再进行移栽试验。分别选用农业土壤、农业土壤+菇渣+沙（211）、农业土壤+泥碳土+沙（211）、珍珠岩+沙（11）、沙为栽培基质，在荫棚内进行移栽。2结果与分析2.1剑麻比较易还原长出新生植株的组织部位在采用不同的外植体钻心苗茎尖、珠芽苗茎尖、珠芽苗心叶、花穗枝梗分别接入基本培养基MMS+6-BA 5mg/L+IBA 0.3 mg/L和N6+2,4-D 2 mg/L+6-BA 1 mg/L+IBA 0.3 mg/L中，于45 d后在不受污染的试管中调查所诱导出的优质芽数，结果见表1和表2。从表1可以看出，珠芽苗茎尖作为外植体接入MMS+6-BA 5 mg/L+IBA 0.3mg/L培养基中培养易还原长出优质新生芽（图1）；从表2可以看出，珠芽苗心叶接入N6+2,4-D 2 mg/L+6-BA 1mg/L+IBA 0.3 mg/L培养基中培养易诱导愈伤组织，并还原出优质植株。2.2不同基本培养基对芽分化的影响当在基本培养基MS、N6和MMS中都添加6-BA 5mg/L、IBA 0.3 mg/L、琼脂粉浓度为8 g/L时，芽分化情况差异较大。从表3可以看出，MS培养基中每30个外植体中平均只有6个外植体出芽，出芽率为20%，且绝大多数是单芽；MMS培养基中出芽率为53.3%，能分化出大多数正常丛生芽；N6培养基中出芽率为16.6%，出芽少，芽弱。因此对外植体直接出丛生芽而言，最好的基本培养基为MMS。2.3不同激素种类和浓度组合对不定芽增殖的影响对诱导分化出的不定芽进行增殖培养（MMS为基本培养基），于45 d后进行观察（图2）。在不受污染的培养瓶中调查所诱导的芽数目，计算接种平均芽数，结果见表4。由表4可以看出，在本试验中使用6-BA和IBA的浓度范围内，6-BA和IBA相互作用的诱导效果尚无相应规律性的变化，但从总体来看，以6-BA 5 mg/L和IBA 0.3mg/L组合的增殖效果最好，增殖系数达到4.6。2.4不同NAA浓度对生根培养的影响在继代培养的无菌芽中，切长约5 cm的芽苗接种于1/2MMS生根培养基中，45 d后调查生根株数（图3），结果见表5。由表5可以看出，在一定的浓度范围内，生根率随27成活率（%）69.084.695.576.675.5成活株数（株）265368535265311移栽株数（株）384435560346412基质表7不同基质对剑麻组培苗移栽成活率的影响注：农业土壤；农业土壤+菇渣+沙（211）；农业土壤+泥碳土+沙（211）；珍珠岩+沙（11）；沙。图4生根苗的移栽生根率（%）92.593.189.6生根数（株）252726接种数（株）272929生长量（cm）4.15.04.2平均抽芽数（个）3.03.12.8抽芽总数（个）675366调查数（个）221724碳源白砂糖蔗糖葡萄糖表6不同碳源对剑麻组培增殖及生根培养的影响增殖培养生根培养图3生根培养生根率（%）59.495.550.0生根数（株）172226384319接种数（株）536160644538NAA浓度（mg/L）表5不同NAA浓度对生根的影响着NAA浓度的增加而增高，当NAA浓度为1.2 mg/L时，生根率最高，达95.5%；在NAA浓度达1.5 mg/L后，生根率开始下降。2.5不同碳源对增殖与生根培养的影响无菌芽苗接种在不同碳源的培养基中，45 d后调查增殖培养和生根培养情况，结果见表6。由表6可以看出，3种碳源在诱导增殖效果较为接近，在诱导生根上白砂糖和葡萄糖不如蔗糖理想、但差别不大，因此可以用白砂糖代替蔗糖作为生产剑麻组培苗的碳源。2.6混合基质对移栽成活率的影响剑麻组培苗移植后2个月，调查不同基质移栽苗成活数，计算成活率（图4）。从表7可以看出，剑麻组培苗移栽到农业土壤+菇渣+沙（211）、珍珠岩+沙（11）、沙等3种基质中成活率相近，移栽到农业土壤基质中成活率较低，移栽到农业土壤+泥碳土+沙（211）基质中成活率最高、达95.5%，这可能是泥碳土和沙通气性与透水性好，并且能保持适量湿度的缘故。3结论与讨论3.1 H.11648麻组培苗培育过程中，以珠芽苗茎尖为原始外植体，选用MS+6-BA 5 mg/L+IBA 0.3 mg/L为诱导培养基，诱导效果较好；以珠芽苗心叶为原始外植体，则选用N6+2,4-D 2 mg/L+6-BA 1 mg/L+IBA 0.3 mg/L为诱导培养基，诱导效果较好。继代培养用MMS+6-BA 5 mg/L+IBA 0.3 mg/L为增殖培养基，增殖系数可达4.6；生根培养用1/2MMS+NAA 1.2 mg/L较适宜，生根率最高达95.5%。采用以上培养基进行组织培养，可获得完整H.11648麻组培苗。3.2在碳源选择上，