马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定技术规程

ICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号DB江西省地方标准DB 36/ XXXXXXXXX马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定技术规程Code of practice for identification on the physiological races of phytophthora infestance on potato点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施江西省质量技术监督局发布DB36/ XXXXXXXXX目次前言II1范围12术语和定义13接种体制备14鉴别寄主的培育35接种鉴定36病情调查37生理小种的确定48供试材料的灭活4附录A（资料性附录）致病疫霉菌形态特征5附录B（资料性附录）马铃薯晚疫病菌生理小种的命名方法6前言本标准编写规则符合GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写的规定。本标准由江西省农业农村厅提出并归口。本标准起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：何烈干、邹芬、马辉刚、涂玉琴、王美清、赖金美、朱业斌、朱跃冬、王修慧。6标准名称1 范围本标准规定了马铃薯晚疫病菌采集分离纯化、生理小种室内鉴定的培养基的制备、鉴别寄主的培育、接种鉴定、病情调查、生理小种的鉴定、供试材料的高温灭活处理。本标准适用于马铃薯晚疫病菌的生理小种鉴定。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1 马铃薯晚疫病指由疫霉属致病疫霉Phytophthora infestans (Mont.)De Bary侵染马铃薯所引起的一种毁灭性病害。2.2 接种体用于人工接种鉴定所需的马铃薯晚疫病菌Phytophthora infestans的孢子囊悬浮液。2.3 鉴别寄主一套含有主效抗性基因R1R11和已知无R基因的感病材料（r）的马铃薯品种。2.4 生理小种病原物种内或专化型内在形态上无差异，但在寄主植物的品种上具有显著致病性差异的类群。2.5 人工接种在适宜的条件下，通过人工操作将一定浓度马铃薯晚疫病菌的孢子囊溶液接种到马铃薯植株的适当部位使之发病的过程。2.6 离体叶片接种法使接种体与离体叶片接触以促使组织发病的一种鉴定方法。3 接种体制备3.1 病样的采集在晚疫病发生较为严重的田块，选择具有典型症状的病叶随机采取5片，记录采集时间和地点，放入冰壶内1天内带回实验室进行分离，分离物经形态学鉴定（附录A）为致病疫霉后，再进行分离物纯化和生理小种鉴定。3.2 培养基的制备3.2.1 黑麦培养基称取50g60g黑麦，在蒸馏水中浸泡24h36h，在121高压蒸汽灭菌锅中灭菌30min，取出用双层纱布过滤去渣，上清液补足水至1000mL，加入琼脂20g，用玻棒搅匀，经三角瓶分装好后在121下高压蒸汽灭菌20min。3.2.2 白云豆培养基称取白云豆粉60g，用5060水浴1h2h，双层纱布过滤后加入V8蔬菜汁100mL，琼脂粉20g，CaCO31.4g,加入蒸馏水定容至1000mL后在121下高压蒸汽灭菌20min。3.2.3 选择性培养基在上述2种培养基中分别加入利福平20mgL-1，氨苄青霉素200 mgL-1，70%五氯硝基苯100 mgL-1。3.2.4 MS培养基硝酸钾1900mg，硝酸铵1650mg，磷酸二氢钾170 mg，硫酸镁370 mg，氯化钙440 mg，碘化钾0.83 mg，硼酸6.2 mg，硫酸镁22.3 mg，硫酸锌8.6 mg，钼酸钠0.25 mg，硫酸铜0.025 mg，氯化钴0.025 mg，乙二胺四乙酸二钠37.25 mg，硫酸亚铁27.85 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，盐酸硫胺素0.1 mg，盐酸吡哆醇0.5 mg，烟酸0.5 mg，蔗糖30000 mg，琼脂7000 mg，蒸馏水1000mL，PH调至5.5。3.3 病原物的分离与纯化3.3.1 叶片保湿分离纯化法将具有典型症状的叶片在自来水下冲洗干净，然后用蒸馏水冲洗1遍，用滤纸吸取叶片表层的水分。用灭菌过的剪刀在病健交界处剪取3cm3cm叶块，背面朝上置于0.5%0.8%水琼脂培养基上保湿培养24h，然后用灭菌挑针挑取小块菌丝块，接种在选择性黑麦培养基上，把培养基放在1618的生化培养箱中黑暗培养3d4d后，在从菌落边缘挑取菌丝置于选择性黑麦培养基上，并放入1618的生化培养箱中黑暗培养纯化，备用。3.3.2 块茎夹叶分离纯化法将健康的马铃薯块茎经表明消毒（将马铃薯表面浸入70%-75%的乙醇溶液后取出，用5%-20%NaClO溶液表面消毒5min-10min,用无菌水冲洗3遍）后，用消毒刀切成0.5cm厚左右的薄片，置于灭菌培养皿中，然后在病叶的病健交界处剪取约0.5cm2的叶片组织，置于已消毒的两薯片之间，在1518黑暗条件下培养，3d5d后在薯片上即可见白色霉层，用灭菌挑针在薯片上挑取晚疫病菌菌丝，放在选择性白云豆培养基上，每皿接种3点，将培养皿置于生化培养箱中18黑暗培养7d10d后，在菌落边缘挑取少量菌丝转移到选择性白云豆培养基上，在18黑暗条件下培养纯化，备用。3.4 孢子囊悬浮液的制备菌株在培养基上纯化培养7d后，将其转移至经表面消毒的新鲜薯片上，按3.3.2方法培养使其产生孢子囊，5d7d后薯片表面即可见大量白色霉层，用玻片刮下菌体放入装有3mL灭菌水的离心管中，充分振荡配成孢子囊悬浮液，用双层纱布过滤，血球计数器计数，将浓度调制成每毫升含20003000个孢子囊，将悬浮液置于4冰箱中2h3h诱导游动孢子的释放，备用。4 鉴别寄主的培育统一鉴别寄主（含DR1DR11）均为无菌保存的试管苗，用MS培养基扩繁寄主，待试管苗移植15d20d后，转接到1/2MS培养基山扩繁，20d左右将寄主试管苗扦插于以珍珠岩为基质的塑料盆中，第一周用清水浇灌，之后用营养液浇灌，控制温度2025自然光照条件培养，约30d后取植株中部相同叶龄的健康复叶进行接种鉴定。5 接种鉴定5.1 鉴定方法采用离体叶片接种法。将采集到的健康复叶背面朝上，置于1%水琼脂培养基上，用微量移液器吸取20uL配置的游动孢子悬浮液，接种到叶片中部叶脉的两侧，每个菌株接种10片同一鉴别寄主小叶，重复3次，以无菌水处理为空白对照。5.2 接种管理将接种叶片置于生化培养箱中17黑暗培养，24h后将叶片翻转并密封保湿，在1820光暗交替条件下培养。6 病情调查6.1 调查时间接种后第4d观察记录感病情况，第7d10d观察是否形成菌丝体和孢子囊。6.2 调查方法在低倍显微镜下观察接种部位症状情况，当该叶片产生孢子囊时为感病（S），叶片未见孢子囊的为抗病（R）。若各处理的重复叶片有4/5及以上为感病型，则该菌株对寄主有毒力。如果同一处理的3个重复的结果不一致则视为无效处理。7 生理小种的确定根据供试菌株在统一鉴别寄主山的抗感类型来确定其生理小种类型。各生理小种的命名方法见附录B。8 供试材料的灭活将试验结束后的接种体和植株残留体等集中放入高压灭菌锅中121、20min灭活处理。AA附录A （资料性附录）致病疫霉菌形态特征致病疫霉菌菌落为白色棉絮状，菌丝无色无隔，壁薄，自由分枝，孢囊梗由菌丝生出，直立，无色，合轴分枝，顶端稍膨大并着生孢子囊，孢子囊单孢无色，卵圆形，具半乳突，顶生。BB附录B （资料性附录）马铃薯晚疫病菌生理小种的命名方法根据各供试菌株在11个含单基因（抗性基因）上的表现症状来进行马铃薯晚疫病菌生理小种的命名，所有的生理小种均能侵染不具任何抗性基因的品种（r），如生理小种1.2.3.4，则表明该生理小种除了能侵染不具任何抗性基因的品种（r）外，还可侵染R1、R2、R3和R4，并表现出发病症状，而对R5