第二章 酶化学.ppt

第二章酶化学 酶的概念 酶的分类与命名 酶的化学本质 酶的结构与功能的关系 酶作用的专一性 酶作用的机理 酶促反应的速度和影响酶促反应速度的因素 酶的制备与酶活力的测定 酶的应用 要求掌握酶 酶的活性中心 必需基团 酶原的激活 同工酶和变构酶的概念 掌握酶的分类 化学组成 特性和结合蛋白酶 全酶 类的特性 掌握影响酶促反应的因素 掌握米氏方程和米氏常数的意义 掌握竞争性抑制作用的概念 掌握三种抑制作用对最大速度和Km的影响 一 酶的概念 Enzyme 一 酶定义 是生物体活细胞产生的 在细胞内外均具有催化活性并具有高度专一性的蛋白质 二 酶和一般催化剂相比的共性 1 只能进行热力学上允许进行的反应 2 可以缩短化学反应到达平衡的时间 而不改变反应的平衡点 3 通过降低活化能加快化学反应速度 4 酶在反应前后不发生变化 三 酶作为生物催化剂的特性 1 高效性 通常要高出非生物催化剂催化活性的106 1013倍 1mol过氧化氢酶5 106molH2O21mol铁离子6 10 4molH2O2 用过氧化氢酶在1秒内催化的反应 同样数量的铁需要300年才能反应完 如果人的消化道中没有各种酶类参与催化作用 那么在体温37 的情况下 要消化一餐简单的午饭 大约需要50年 酶是生物催化剂 由于酶的存在 生物体内进行的反应比无生命界中进行的同样反应有效得多 在四支试管中 分别加入过氧化氢溶液 在第一支试管中 可以看到管壁上缓慢的生成气泡 这是过氧化氢自发分解为氢气和氧气 在第二支试管中 加入少许铁屑 可以看到气泡增多 说明铁催化下 过氧化氢分解加快 在第三支试管中 加入少许小鼠肝糜 可以看到气泡急剧增加 说明鼠肝中过氧化氢酶的催化作用比铁屑强的多 在第三支试管中 加入少许煮过的小鼠肝糜 气泡产生情况约与第一支试管相当 说明鼠肝中过氧化氢酶煮后失去活性 没有催化作用 酶的转换数 TN kcat 表示酶的催化效率 是指在一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的分子数 或指每秒钟每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数 2 专一性 酶对底物具有严格的选择性 是酶最重要的特点之一 也是和一般催化剂最主要的区别 酶只能催化一种或一类反应 而一般催化剂没有这种特点 如 氢离子可以催化淀粉 蛋白 脂肪的水解 而淀粉酶只能水解糖苷健 蛋白酶只能催化肽键 脂肪酶只能水解酯健 3 酶易失活 反应条件的温和性酶是细胞产生的生物大分子 凡是能使生物大分子变性的因素都能使酶失活 酸 碱 重金属盐 酶催化的反应往往都是在比较温和的常温 常压和接近中性酸碱下进行 例如 生物固氮 固氮酶每年可以将空气中一亿吨的分子氮固定下来 而化学合成则需要在500 几百个大气压下才能完成 酶促反应一般在pH5 8水溶液中进行 反应温度范围为20 40 C 高温或其它苛刻的物理或化学条件 将引起酶的失活 4 酶活性受到调节和控制 区别于一般催化剂的重要特征 1 调节酶的浓度 一种是诱导或抑制酶的合成 一种是调节酶的降解 例如乳糖操纵子 大肠杆菌的葡萄糖抑制效应 2 通过激素调节酶活性 激素通过与细胞膜或细胞内受体结合而引起的一系列生物学效应 例如乳腺组织合成乳糖 乳糖合成酶由催化亚基和调节亚基组成 催化亚基单独存在不能合成乳糖 调节亚基本身无催化活性 是乳汁中的a 乳清蛋白 与催化亚基结合后催化半乳糖和葡萄糖反应生成乳糖 而调节亚基是受激素调节的 怀孕期间合成少 分娩后由于催乳素大量增加所以调节亚基大量合成 与催化亚基结合成乳糖合成酶 大量合成乳糖以适应生理需要 乳糖不耐症母乳喂养 3 反馈抑制调节酶活性反馈抑制 许多小分子物质的合成是由一连串的反应组成的 催化此物质生成第一步的酶往往被终端产物抑制 A B C D P 终端产物 为P所抑制 4 抑制剂和激活剂对酶活性的影响酶受大分子抑制剂或小分子物质抑制 5 其它方式调节 如别构调控 酶原激活 酶的可逆共价修饰 同工酶调节等等 二 酶的分类与命名 一 1961年国际酶学委员会 EnzymeCommittee EC 根据酶所催化的反应类型和机理 把酶分成6大类 1 氧化还原酶类 主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应 AH2 B O2 A BH2 H2O2 H2O 1 脱氢酶类 催化直接从底物上脱氢的反应 AH2 B A BH2 需辅酶 或辅酶 2 氧化酶类 催化底物脱氢 氧化生成H2O2 AH2 O2 A H2O2 需FAD或FMN 催化底物脱氢 氧化生成H2O 2AH2 O2 2A 2H2O 3 过氧化物酶 ROO H2O2 RO H2O O2 4 加氧酶 双加氧酶和单加氧酶 顺 顺 已二烯二酸 RH O2 还原型辅助因子 ROH H2O 氧化型辅助因子 又称羟化酶 2 转移酶类 催化化合物中某些基团的转移 A X B A B X 根据X分成8个亚类 转移碳基 酮基或醛基 酰基 糖基 烃基 含氮基 含磷基和含硫基的酶 3 水解酶类 催化加水水解作用 属于细胞外酶 在生物体内分布最广 数量也多 包括水解酯键 糖苷键 醚键 肽键 酸酐键等 AB H2O AOH BH 4 裂解 合 酶类 催化从底物移去一个基团而形成双键的反应或逆反应 C C键 CO2 C O键 H2O C N键 NH3 5 异构酶 催化各种异构体之间的互变 常见的有消旋和变旋 醛酮异构 顺反异构和变位酶类 6 合成酶类 催化有ATP参加的合成反应 二 酶的命名有两种方法 系统名 惯用名 系统名 包括所有底物的名称和反应类型 乳酸 NAD 丙酮酸 NADH H 乳酸 NAD 氧化还原酶 惯用名 只取一个较重要的底物名称和反应类型 乳酸 NAD 氧化还原酶 乳酸脱氢酶 对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型 三 酶的化学本质 一 大多数酶是蛋白质 1926年J B Sumner首次从刀豆制备出脲酶结晶 证明其为蛋白质 并提出酶的本质就是蛋白质的观点 酶是蛋白质的证据 1982年T Cech发现了第1个有催化活性的天然RNA ribozyme 核酶 以后Altman和Pace等又陆续发现了真正的RNA催化剂 核酶的发现不仅表明酶不一定都是蛋白质 还促进了有关生命起源 生物进化等问题的进一步探讨 二 酶的化学组成 酶 单纯酶 结合酶 全酶 酶蛋白 非蛋白小分子或金属离子 脱辅酶 辅因子 同时存在才起作用 脱辅酶对辅酶或辅基有选择性 辅因子 辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物 透析除去 辅基 与酶蛋白结合得紧密 不易除去 金属激活剂 金属离子作为辅助因子 脱辅酶只能与一定的辅因子结合 同时一种辅因子又可与多种脱辅酶结合 脱辅酶决定酶的催化专一性 辅因子通常是作为电子 原子或某些化学基团的传递作用 只含有蛋白质成分 三 酶的分类 按照肽链的组成分类 1 单体酶 monomericenzyme 2 寡聚酶 oligomericenzyme 3 多酶复合物 multienzymesystem 一般只具有一条肽链 种类较少 多是催化水解反应的酶 由几个或多个亚基组成 亚基牢固地联在一起 单个亚基没有催化活性 亚基之间以非共价键结合 寡聚酶是调控酶 在代谢调控中起作用 几个酶镶嵌而成的复合物 这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应 丙酮酸脱氢酶系 E coli 丙酮酸脱氢酶 E 硫辛酰转乙酰酶 E 和二氢硫辛酰脱氢酶 E 碱性 四 酶作用的专一性及其假说 酶作用的专一性 结构专一性 立体异构专一性 相对专一性 绝对专一性 旋光异构专一性 几何异构专一性 族专一性键专一性 一 结构专一性 包括绝对专一性和相对专一性1 绝对专一性 酶对底物的要求严格 只作用于一种底物 而不作用于其它物质 脲酶 尿素 麦芽糖酶 麦芽糖2 相对专一性 可作用于一类结构相似的底物 包括族专一性和键专一性 族专一性 酶对链两端的基团要求程度不同 对其中一个基团要求高 对另一个要求不严格 如a D葡萄糖糖苷酶 要有a 糖苷键和葡萄糖残基 键专一性 只要求作用于底物一定的键 对两端的基团无严格要求 如酯酶 绝对专一性 2NH3 CO2 族专一性 键专一性 催化反应式 凝血酶 水解羧基端为精氨酸氨基端为甘氨酸之间的肽键胰蛋白酶 水解赖氨酸或精氨酸羧基形成的肽键胰凝乳蛋白酶 专一地水解由芳香族氨基酸或带有较大非极性侧链氨基酸羧基形成的肽键 弹性蛋白酶 专一水解丙氨酸 甘氨酸及短脂肪链氨基酸羧基形成的肽键 胃蛋白酶 水解芳香族氨基酸或疏水性氨基酸羧基或氨基形成的肽键 氨肽酶 水解氨基末端氨基酸 羧肽酶 水解羧基末端氨基酸 二 立体异构专一性1 旋光异构专一性 L型和D型 如L 氨基酸氧化酶只能催化L 氨基酸 2 几何异构专一性 顺反异构 如琥珀酸脱氢酶只能催化琥珀酸生成延胡索酸 反丁烯二酸 而不能生成顺丁烯二酸 琥珀酸 琥珀酸脱氢酶 延胡索酸 二 关于酶作用专一性的假说1 1894年 Fisher提出的 锁与钥匙学说 内容 酶与底物为 锁与钥匙 的关系 即酶与底物在结构上的互补性 酶的活性中心结构与底物的结构互相吻合 紧密结合成中间络合物 局限性 催化可逆反应的酶不可能既与底物的结构吻合 又与产物的结构吻合 AB E 锁与钥匙学说示意图 底物 酶 活性部位 ES中间复合物 2 诱导契合 嵌合 学说 Koshland 1958 内容 酶活性中心的结构有一定的灵活性 当底物 激活剂或抑制剂 与酶分子结合时 酶蛋白的构象发生了有利于与底物结合的变化 使反应所需的催化基团和结合基团正确排列和定向 转入有效的作用位置 这样才能使酶与底物完全吻合 结合成中间产物 过程 底物靠近酶时 诱导酶的构象发生变化 从而与底物结合 诱导嵌合学说 底物 酶 Twomodelsforenzyme substrateinteraction 一 活性部位 1 定义活性部位 活性中心 酶分子中直接与底物结合 并催化底物发生化学反应的区域 必需基团 活性部位 维持酶的空间结构 结合部位 催化部位 决定了酶的专一性 决定了酶促反应的类型 即催化性质 五 酶的作用机理 2 活性中心的特点 1 活性中心在酶分子中只占很小的一部分 体积的1 3 2 酶的活性中心具有三维空间结构 由一级结构决定的 酶的空间结构决定了活性部位的空间结构 一旦酶的高级结构受到影响 则活性中心破坏 酶失活 3 构成酶活性中心的几个氨基酸在一级结构上并不紧密邻近 可能相距很远 甚至在不同的肽链上 但由于折叠弯曲彼此靠近并形成特定的空间结构的区域 如胰凝乳蛋白酶的活性中心的三个氨基酸 His12 Asp102 Ser195 4 酶的活性中心和底物不是正好互补的 酶或底物分子有时两者的构象同时发生变化彼此才互补 5 酶的活性中心位于酶分子表面的一个裂缝内 裂缝内是一个疏水的环境 非极性基团较多 有助于与底物的结合 6 底物通过次级键较弱的作用力与酶结合 氢键 离子键 范德华力 疏水相互作用 7 酶的活性中心具有柔性和可运动性 二 必需基团活性中心内必需基团 出现于活性中心并参与催化反应的基团 一种酶活性中心必需基团一般含1 3个氨基酸 其在活性中心的位置和取向决定酶催化效率的高低 这些基团若经过化学修饰而发生改变 酶活性就丧失 活性中心外必需基团 在活性中心以外也有一些基团 对维持酶的空间构象起重要作用 关系到酶活性中心必需基团的相对位置 这些基团如果被修饰则会引起酶分子以至活性中心的构象发生改变 最终使酶活性丧失 这些基团属于活性中心外必需基团 必需基团 活性中心外必需基团 活性中心内必需基团酶活性中心和酶蛋白空间构象完整性之间是辨证统一的 三 影响酶催化效率的因素 酶分子为酶的催化提供各种功能基团和形成特定的活性中心 酶与底物结合成中间产物 使分子间的催化反应转变为分子内的催化反应 1 底物和酶的邻近效应与定向效应 邻近效应 酶与底物形成中间复合物后使底物之间 酶的催化基团与底物之间相互靠近 提高了反应基团的有效浓度 E SESE P定向效应 由于酶的构象作用 使得底物的反应基团之间 酶与底物的反应基团之间正确取向的效应 酶把底物分子从溶液中富集出来 使它们固定在活性中心附近 反应基团相互邻近 同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠 反应易于发生 邻近效应与定向效应对反应速度的影响 使底物浓度在活性中心附近很高 酶对底物分子的电子轨道具有导向作用 酶使分子间反应转变成分子内反应 邻近效应和定向效应对底物起固定作用 2 底物的形变和诱导契合 酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化 产生电子张力 降低了底物的活化能 酶从低活性形式转变为高活性形式 利于催化 底物形变 利于形成ES复合物 底物构象变化 形成过渡态结构 大大降低活化能 3 酸碱催化 酶分子的一些功能基团起瞬时质子供体或质子受体的作用 通过瞬时地向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态 加速反应 影响酸碱催化反应速度的两个因素 酸碱强度 pK值 组氨酸咪唑基的解离常数为6 在pH6附近给出质子和结合质子能力相同 是最活泼的催化基团 给出质子或结合质子的速度 咪唑基最快 半寿期小于10 10秒 4 共价催化 酶亲核基团 Ser OH Cys SH His N Asp COOH 底物亲电中心 磷酰基 P O 酰基 C O 糖基 Glu C OH 某些辅酶 如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用 酶活性中心的极性基团与底物结合 形成一个活性很高的共价中间产物 此中间产物很容易变成过渡态 使反应活化能大大降低 从而提高反应速度的过程 称为共价催化 7 活性部位微环境的影响 疏水环境介电常数低 加强极性基团间的作用 疏水环境有利于酶的催化作用 电荷环境在酶活性中心附近 往往有一电荷离子 可稳定过渡态的离子 5 金属离子催化金属酶 含有紧密结合的金属离子 Fe Cu 和金属激活酶 含松散结合的金属离子 Na K 等 6 协同催化几个基元催化反应配合在一起共同起作用 是多元催化协同作用的结果 六 酶促反应的速度和影响因素 一 酶反应速度的测量 用一定时间内底物减少或产物生成的量来表示酶促反应速度 测定反应的初速度 研究酶促反应速度 以酶促反应的初速度为准 因为底物浓度降低 酶部分失活 产物抑制和逆反应等因素 会使反应速度随反应时间的延长而下降 二 底物浓度对酶促反应速率的影响 1 底物浓度与酶促反应速度的关系Vmax 最大反应速度Km 米氏常数1 2Vmax 最大反应速度的一半S 底物浓度V 酶促反应速率 1 当底物浓度很低时 V与 S 呈现直线关系 这时随着底物浓度的增加 反应速度按一定比率加快 为一级反应 2 当底物浓度增加到一定程度时 虽然反应速度仍随着底物浓度的增加而增加 但增加的比率不再是定值 而呈现逐渐减弱的趋势 表现为混合级反应 3 当底物浓度增加到足够大的时候 V便达到一个极限值 此后V不再受到底物浓度的影响 这个极限值称为酶的最大反应速度 Vmax 底物浓度对酶促反应速度的影响图 一级反应 混合级反应 零级反应 底物浓度与反应速度关系曲线的原因中间产物学说 酶在催化底物发生变化时 酶分子首先与底物结合成一个不稳定的过渡态中间产物ES 然后经过原子间的重新键合 中间产物ES释放出游离酶 S 底物 E 酶 ES 中间产物 1 当底物浓度很低时 有多余的酶没与底物结合 随着底物浓度的增加 中间络合物的浓度不断增高 从而增加酶促反应的速度 2 当底物浓度较高时 溶液中的酶全部与底物结合成中间产物 即使再增加底物浓度也不会有更多的中间产物生成 因为体系中已经没有游离态的酶了 速度也不会再增加 饱和浓度 酶的活性中心全部被底物分子结合时所需的底物浓度 催化剂 反应物 酶促反应动力学方程 米氏方程式 Michaelis Mentenequation 1913年 Michaelis Menten利用中间产物学说推导的表示底物与酶促速度之间定量关系的数学方程式 1925年 Briggs Haldane提出稳态理论对米氏方程进行了修正 稳态理论 反应进行一段时间后 系统的复合物ES的浓度由零逐渐增加到一定数值 在一定时间内 尽管底物浓度和产物浓度不断变化 复合物ES也在不断的合成和分解 但是当系统中ES的生成速率和分解速率相等时 络合物ES浓度保持不变的这种反应状态称为稳态 米氏方程式 如果要求酶促反应v 90 Vmax 则 S 应为Km的倍数是 米氏方程可以说明以下关系 1 S Km时 所以V与 S 成正比 符合一级动力学 酶没有被全部饱和 由于底物浓度低 所以是不能正确酶活力的 2 S Km时 v vmax 底物浓度远大于Km时 酶全部被饱和 达到最大反应速度 v与 S 无关 符合零级动力学 只有在此条件下才可以测得酶活力 3 S Km时 V 1 2Vmax 因此Km代表酶反应速度达到最大反应速度一半时得底物浓度 3 米氏常数的意义及测定 当v Vmax 2时 则 km S 物理意义 米氏常数为酶促反应速度等于最大反应速度一半时所对应的底物浓度 单位为mol L 3 当k2 k3时 km k2 k1 km ks 可以表示酶与底物的亲和性 2 从km可判断酶的专一性和天然底物 Km最小的底物 通常就是该酶的最适底物 也就是天然底物 1 Km可近似表示酶对底物的亲和力 1 Km越大 酶对底物的亲和力越大 因为Km越小 达到最大反应速度一半时所需的底物浓度越小 所以最适底物亲和力最大 即Km越小 亲和力越大 Km的大小与亲和力大小成相反的关系 即Km越大 亲和力越小 Km越小 亲和力越大 1 km是酶的一个基本的特征常数 其大小与酶的浓度无关 而与具体的底物有关 且随着温度 pH和离子强度而改变 对某一酶促反应而言 在一定条件下都有特定得Km值 各种酶的Km值相差很大 米氏常数的意义 km k2 k3 k1 Km k2 k1 km可以看作ES的解离常数ks 当km大 说明ES容易解离 酶与底物结合的亲和力小 4 已知某个km的大小 可以知道反应速度相当于最大反应速度的百分率 从米氏方程中求得 当反应速度达到最大反应速度的90 则 90 Vm 100 Vm S km S 即 S 9km 5 km还可以推断某一反应的方向和途径 丙酮酸 乳酸 乙酰CoA 乙醛 乳酸脱氢酶 Km 1 7 10 5 丙酮酸脱氢酶 Km 1 3 10 3 丙酮酸脱羧酶 Km 1 0 10 3 生物体内的代谢反应往往是在多酶体系进行的 同一种底物往往可被几种酶催化 催化不同的反应 走不同的途径 当丙酮酸浓度较低时 代谢走哪条途径决定于km最小的酶 km小的酶反应占优势 当一系列不同的酶催化一个代谢过程的连锁反应时 如能确定各种酶的的Km及相应底物的浓度 便可有助于寻找代谢过程的限速步骤 ABCD123相应底物A B C的Km分别为10 2mol L 10 3mol L 10 4mol L 而细胞内A B C的浓度均接近于10 4mol L 推断限速步骤 4 Km和Vm的求法 通常用Lineweaver Burk作图法 双倒数作图法 y ax b 与y轴的截距为1 Vm与x轴的截距为 1 Km 三 酶浓度对酶促反应速率的影响 当酶促反应体系的温度 pH不变 底物浓度足够大 足以使酶饱和 则反应速度与酶浓度成正比 因为在酶促反应中酶分子首先与底物分子作用 生成活性的中间产物ES 然后转变为最终产物 在底物充分过量的情况下 可以设想 酶的数量越多则生成的中间产物ES也越多 反应速度越快 相反如果反应体系中底物不足 酶分子过量 则即使再增加酶浓度也不会增大酶促反应速度 四 温度对酶作用的影响 两种不同影响 1 温度升高 活化分子多 酶促反应快 反应速度加快 2 酶是蛋白质 随着温度升高而使酶逐渐变性 酶活力下降而降低酶的反应速度 一般情况下 低温下酶可长时间发挥作用 酶的固体状态比液体状态对温度的耐受力强 酶的冻干粉可在冰箱中放置几个月 而酶溶液只能保存几周 最适温度 最适温度 曲线顶峰处最大反应速度对应的温度 通常动物体内的酶的最适温度一般35 40 植物体内的酶一般40 55 大部分酶在60 以上即变性失活 五 pH对酶作用的影响 1 最适pH 2 pH稳定性 表现出酶最大活力的pH值 在一定的pH范围内酶是稳定的 动物体内的酶多在6 5 8 0 植物及微生物的酶多在4 5 6 5 胃蛋白酶的最适pH为1 5 虽然大部分酶的pH 酶活曲线是钟形 但也有半钟形甚至直线形 pH对酶作用的影响机制 1 环境过酸 过碱破坏酶的空间结构 引起酶的构象改变 酶活性丧失 2 影响酶活性基团的解离 从而影响与底物的结合 使得酶的活性降低 3 影响维持酶分子空间结构的有关基团解离 从而影响酶活性部位的构象 而影响酶的活性 六 激活剂对酶作用的影响 凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂 激活剂对酶的作用具有选择性 一种激活剂对某种酶起激活作用 而对另一种酶可能起抑制作用 如Cl 是唾液淀粉酶的激活剂 Mg2 激活脱羧酶 而对肌球蛋白腺三磷酸酶起抑制作用 主要分为三类 无机离子 中等大小的有机分子 具有蛋白质性质的大分子 七 抑制剂对酶作用的影响抑制剂 能使酶的必需基团的化学性质改变而降低酶的催化活性 甚至使酶的催化活性完全丧失的物质 抑制作用 使酶的催化活性降低或丧失 而不引起酶蛋白变性的作用 抑制剂对酶的作用有选择性 变性作用 酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用 变性剂对酶的作用无选择性 1 不可逆的抑制作用抑制剂与酶活性中心 外 的必需基团以牢固的共价键结合 使酶的活性降低或丧失 无法用透析 超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶的活性 抑制作用分为可逆和不可逆两大类 不可逆抑制剂有以下几类 有机磷化合物 与酶活性中心的丝氨酸羟基结合 强烈抑制与中枢神经系统有关的乙酰胆碱酯酶的活性 乙酰胆碱过量积累 使得神经系统处于过渡兴奋状态 引起神经中毒 神经毒剂 敌敌畏 敌百虫等 有机汞 有机砷化合物 与酶中Cys的巯基作用 抑制含巯基的酶 这类抑制可通过加入过量的巯基而解除 重金属盐 Pb Hg Cu Fe Ag在高浓度时使酶蛋白变性失活 可加入EDTA Cys等除去重金属离子 烷化试剂 含活波的卤素原子 如碘乙酸等抑制含巯基的酶 氰化物 硫化物和CO 与酶中金属离子结合成络合物使酶的活性受到抑制 青霉素 细菌细胞壁合成受阻 杀菌作用 2 可逆的抑制作用抑制剂与酶蛋白非共价键结合 可以用透折 超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活 可逆抑制剂 竞争性抑制剂 I和S结构很相似 抗癌药5 F U阻碍核酸的正常合成 使得癌细胞无法正常繁殖 磺氨类药物 与对氨基苯甲酸结构类似 参与四氢叶酸的形成 1 竞争性抑制 Competitiveinhibition 抑制剂具有与底物类似的结构 竞争酶的活性中心 并与酶形成可逆的EI复合物 阻止底物与酶结合 可以通过增加底物浓度而解除此种抑制 I是抑制剂 丙二酸是琥珀酸脱氢酶的的竞争性抑制剂 Competitiveinhibition Effectsofcompetitiveinhibitiononenzymekinetics 2 非竞争性抑制 noncompetitiveinhibition 底物和抑制剂可以同时与酶结合 但是 中间的三元复合物ESI不能进一步分解为产物 因此 酶的活性降低 抑制剂与酶活性中心以外的基团结合 其结构可能与底物无关 抑制程度取决于I的绝对浓度 不能通过增加底物浓度的办法来消除非竞争性抑制作用 亮氨酸是精氨酸的非竞争性抑制剂 Noncompetitiveinhibition Effectsofnoncompetitiveinhibitiononenzymekinetics 3 反竞争性抑制底物先与酶结合 才能与抑制剂结合 E S ES I ESI P 抑制取决于I的绝对浓度 不能通过增加底物来解除 常见于多底物的酶促反应中 3 可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别 1 通过透析 超滤 凝胶过滤等2 通过v E速度曲线 动力学方法 1 反应体系中不加I 无抑制剂时 加入E立即表现出活力 2 反应体系中加入一定量的不可逆抑制剂 加入不可逆抑制剂时 加入少量的酶均被抑制 所以开始未表现出活力 3 反应体系中加入一定量的可逆抑制剂 可逆抑制剂使酶的活力降低 所以表现出较低的活力水平 I 增高 I 增高 4 通过可逆抑制剂的动力学曲线区分三种可逆抑制作用 可逆抑制作用动力学 1 竞争性抑制 动力学方程 Ki为EI的解离常数 Vmax不变 Km变大 而且随 I 浓度的增大而增大 2 非竞争性抑制 动力学方程 Km不变 Vmax降至Vmax 1 I Ki 3 反竞争性抑制 动力学方程 Km及Vmax都变小 可逆抑制的动力学比较 抑制类型Vmax变化Km变化无抑制剂不变不变竞争性抑制作用不变变大非竞争性抑制作用变小不变反竞争性抑制作用变小变小 八 酶活性的调节控制 1 别构调控1 1 别构调控 酶分子的非催化部位与某些化合物可逆非共价结合后发生构象变化 进而改变酶的活性状态 别构酶 具有别构调节作用的酶 能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物 通常是小分子的代谢物或辅因子 因别构导致酶活性增加的为正效应物或别构激活剂 使酶活性降低的为负效应物或别构抑制剂 1 2 别构酶的特点 1 一般是寡聚酶 2 具有别构效应 3 K型效应物和V型效应物 改变Km而不改变Vm的为Km型 改变Vm不改变Km为Vm4 v对 S 不呈直角双曲线 Rs 81米氏类型酶Rs 81具有正协同效应的别构酶Rs 81具有负协同效应的别构酶 Koshland标准 CI cooperativityindex 协同指数 酶分子中的结合位点被底物饱和90 和10 时底物浓度的比值 亦称饱和比值Rs saturationratio 酶与底物结合达10 饱和度时底物浓度 酶与底物结合达90 饱和度时底物浓度 Rs 1 3 区分酶的类型的标准 别构酶与米氏酶的动力学曲线比较 酶结合一分子底物或效应物后 酶的构象发生了变化 新的构象大大增加了对后续底物分子的亲和性 促进后续分子与酶的结合 表现为正协同性 在正协同效应中使得酶反应速度对底物浓度的变化极为敏感 具有负协同效应的酶在底物浓度较低的范围内酶活力上升快 但随后底物浓度虽有较大的提高 但反应速度升高却很小 使得酶反应速度对底物浓度的变化不敏感 天冬氨酸转氨甲酰酶 ATCase ATCase 氨甲酰磷酸 天冬氨酸 氨甲酰天冬氨酸 ATCase变构效应的动力学特征 Vmax 1 2Vmax Km 2 酶原的激活 体内合成的蛋白质有时不具有生物活性 经过蛋白水解酶专一作用后 构象发生变化 形成酶的活性部位 变成活性蛋白 没有活性的酶的前体称为酶原 酶原转变成有活性的酶的过程称为酶原的激活 这个过程实质上是酶活性部位形成和暴露的过程 在组织细胞中 某些酶以酶原的形式存在 可保护分泌这种酶的组织细胞不被水解破坏 如 消化系统蛋白酶原的激活 胰凝乳蛋白酶 弹性蛋白酶和羧肽酶都是以酶原形式在胰腺中产生 胰脏中酶原的激活要通过胰蛋白酶的作用 因此在胰腺中存在着大量的胰蛋白酶的抑制剂 抑制胰蛋白酶的作用 胰蛋白酶原 胰蛋白酶 六肽 肠激酶 活性中心 胰蛋白酶原的激活示意图 Zymogenactivationbyproteolyticcleavage 胰蛋白酶原 肠激酶 胰凝乳蛋白酶原 弹性蛋白酶原 胰蛋白酶 羧肽酶原 弹性蛋白酶 羧肽酶 胰凝乳蛋白酶 3 可逆的共价修饰共价调节酶 通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰 使酶处于活性和非活性的互变状态 蛋白激酶蛋白质蛋白质 pi 活性 蛋白磷酸化酶 ATP H2O 4 同工酶同工酶 指催化相同的化学反应 但其蛋白质分子结构 理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶 乳酸脱氢酶同工酶形成示意图 多肽 亚基 mRNA 四聚体 结构基因 ab 不同组织中LDH同工酶的电泳图谱 心 肝病变时引起的血清LDH同工酶的变化规律 心脏疾病LDH1和LDH2上升 LDH3和LDH5下降 急性肝炎LDH5明显上升 随病情好转而恢复正常 七 酶的制备与活力的测定 一 酶活力的相关概念1 酶活力是指酶催化某一化学反应的能力 2 酶 活力 单位 在一定条件下 一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量 U g U ml 3 酶活力的国际单位 1961年 在最适的反应条件 25 下 每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位 1IU 1 mol min 4 酶活力国际单位 1972年 Kat单位 在最适条件下 每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1kat单位 即1kat 1mol s 1kat 6 107IU 二 酶的制备1 方法 工业上大多采用微生物发酵的方法来获得大量酶制剂 优点 不受气候 地理条件的限制 动 植物体内的酶大多可从微生物体内找到 微生物繁殖快 产酶量由丰富 还可以通过选育菌种来提高酶的产量和用廉价原料大量生产 2 酶分离纯化的三个基本步骤 抽提 纯化 结晶或制剂 酶的提纯包括两方面的工作 一是把酶制剂从很大体积浓缩到很小体积 二是把酶制剂中的大量杂蛋白和其他大分子除去 判断分离提纯方法的优劣 两个指标 一是总活力的回收 二是比活力提高的倍数 总活力的回收表示酶提纯过程中的损失情况 而比活力提高的倍数则表示提纯方法的有效程度 3 酶分离的方法 1 根据溶解度不同 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 选择性沉淀法 2 根据酶蛋白分子大小的差别 凝胶过滤法 超离心法 3 根据酶蛋白与吸附剂之间吸附与解吸附性质的不同 吸附分离法 4 根据带电性质 离子交换层析法 电泳分离法 等电聚焦层析法 5 根据酶蛋白的稳定性差别 选择性变性法 6 根据酶与底物 辅因子或抑制剂之间的专一性亲和作用 亲和层析法 酶的纯度 比活力的定义 每mg蛋白质所含的酶活力单位数 对于同一种酶来说 比活力越大 酶的纯度越高 比活力 活力单位数 毫克蛋白 氮 酶的纯化鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 等电聚焦电泳法 4 酶的保存 1 低温 0 4 20 2 高浓度较稳定 3 加入稳定剂 4 固定化 固定化酶 将水溶性的酶用物理或化学方法处理 使之称为不溶水的 但仍具有酶活力的状态 吸附法 使酶被吸附于惰性固体的表面 或吸附于离子交换剂上 包埋法 使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中 偶联法 使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上 交联法 使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成 网状 结构 物理方法 化学方法 九 酶的应用 工业上酶应用的优点 酶的催化效率高 专一性强 不发生副作用 酶作用条件温和 酶及其反应产物大多无毒性 酶工程 酶的生产 制备和应用 1 1ug纯酶 Mr 92 103 在最适条件下 催化反应速率为0 5umol min 计算酶的比活力和转换数2 称取25mg蛋白酶配成25ml溶液 取2ml溶液用凯氏定氮法测得含蛋白氮0 2mg 另取0 1ml溶液测酶活力 以酪蛋白为底物 用Folin 酚比色法测定酶活 结果每小时可以水解酪蛋白产生1500ug酪氨酸 假定1个酶活力单位定义为每分钟产生1ug酪氨酸的酶量 请计算 1 1mL酶液所含的蛋白质含量及活力单位 2 比活力 3 1g酶制剂的总蛋白含量及总活力 反馈抑制 在代谢过程中局部反应产物对催化该反应的酶所起的抑制作用 抑制 反馈抑制可认为是可逆抑制 别构抑制 酶的别构位与变构剂结合即会引起酶活性位的构象改变从而改变酶的活性 凡因负变构剂与酶的别构位结合而引起的酶活性下降称为别构抑制 抑制作用的机制 1 抑制剂与酶结合成极稳定的络合物 从而减低或破坏酶的活性 2 破坏酶或辅基的活性基团或改变活性位的构象 如重金属 Ag Hg2 和类金属 As3 破坏SH 3 夺取酶与底物结合的机会 从而减少酶的作用 竞争性抑制剂 小结 生物体内所有的反应均在常温 常压和近中性温和的内环境条件下进行 这是因为生物体内存在着一种生物催化剂 酶 酶是由活细胞产生 能在体内外对其底物 作用物 起催化作用的一类蛋白质 酶与一般催化剂的不同点在于酶具有极高的催化效率 高度专一性 特异性 高度不稳定性和酶活性的可调控性 根据酶对底物专一性不同 可分成三种类型 1 绝对专一性 2 相对专一性 3 立体异构专一性 酶按其分子组成可分成单纯蛋白酶和结合蛋白酶 全酶 两类 前者酶分子全部由氨基酸组成 如蛋白酶 脂肪酶 淀粉酶等 结合蛋白酶的分子组成除含蛋白质部分 称酶蛋白 外 还含有非蛋白质部分 称辅助因子 根据与酶蛋白结合的牢固程度不同又可分为辅基和辅酶 辅助因子由金属离子 B族维生素衍生物等组成 酶蛋白与辅酶 辅基 的关系是 一种酶蛋白只能与一种辅酶 辅基 结合生成一种全酶 催化一种反应 而一种辅酶 辅基 可与多种酶蛋白结合生成不同全酶 催化不同的反应 因而酶蛋白决定反应专一性 辅酶则具体参加反应 酶蛋白与辅酶单独存在时均无活性 只有结合成全酶 才有活性 酶的本质是蛋白质 其分子大小和分子量远比其底物要大得多 因此底物与酶的结合范围只能集中在酶分子某个表面处的裂缝或凹陷区域 在此区域中 集中了与酶活性密切有关的基团 称酶活性必需基团 常见的必需基团有丝氨酸的羟基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基以及谷氨酸和天冬氨酸的侧链羧基等 因此将这些必需基团比较集中 并构成一定空间构象