设备管理_植物组织培养实验室的组成仪器设备及基本操作

植物组织培养实验室的组成 仪器设备及基本操作 一 植物组织培养实验室的结构及设计要求 完整的植物组织培养室通常包括洗涤室 化学实验室 接种室 培养室 细胞学实验室等部分 可以根据实际需要和条件进行设计 但从功能上至少包括准备室 化学实验室 接种室以及培养室三部分 并且按顺序排列 在化学实验室与接种室之间应留有缓冲空间 第一节实验室结构 仪器设备及操作技术 一 准备室 化学实验室 1 主要功能 用于培养器皿的清洗 干燥 培养基的配制 分装和灭菌 试管苗的出瓶及整理等工作 2 主要仪器设备及用品 药品柜 实验台 水槽 超声波洗涤仪 凉干架 干燥箱 各种玻璃器皿 烧杯 量筒 容量瓶 试剂瓶 三角瓶等 蒸馏水制造装置 天平 移液器 pH计 水浴锅 微波炉 电炉 磁力搅拌器 蠕动泵 及培养基分装用品等 高压灭菌锅 冰箱 二 接种室 无菌操作室 1 功能 接种材料的灭菌 接种以及培养物的继代转接等 接种室要求保持洁净 与化学实验室之间应设置缓冲室 2 仪器设备及用品 超净工作台 紫外灯 小推车 搁架 磁盘 接种工具 各种镊子 解剖刀 手术剪 普通剪刀接种针 酒精灯 手持喷雾器 细菌过滤器等 等 三 培养室 1 功能 主要用于植物材料的培养 要求室内洁净并能保持一定的温度 光照以及湿度 以促进植物材料的生长和分化 2 仪器设备及用品 培养架及灯管 摇床 振荡器 空调 自动定时器 加湿及除湿器 光照培养箱等 四 细胞学实验室 1 功能 主要用于培养材料的显微观察及照相等 2 仪式设备及用品 体视显微镜 普通显微镜 倒置显微镜 荧光显微镜 配套显微照相装置 普通相机或数码相机 切片机及配套制片及染色用品等 体视显微镜 用途 放大倍数5 80倍主要用于植物形态分化的观察 茎尖的切取 普通光学显微镜 用途 用于植物切片观察 确定植物的发育进程 如 不定芽 不定胚的分化过程以及其它器官组织的分化等 倒置显微镜 用途 主要用于细胞 原生质体的细胞分裂和细胞团形成的观察 一 洗涤 1 普通器皿 采用洗衣粉 洗洁精等中性洗涤剂洗涤 2 难清洗器皿及移液管等 用水清洗后再用重铬酸钾洗液浸泡 最后清水冲洗 或用超声波仪清洗 重铬酸钾洗液的配制方法 43g重铬酸钾溶于1000ml蒸馏水中 将浓硫酸缓慢倒入重铬酸钾溶液中 浓度比例为1 1 二 实验室基本操作 1 器具灭菌 培养皿 解剖刀 镊子等用品 1 干热灭菌 铝箔包好后 放于恒温干燥箱内 150 保温2小时 成本较高 2 高压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌锅内120 15 20分钟 3 灼烧灭菌 接种时 解剖刀及镊子等浸入95 乙醇 然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌 二 灭菌 灭菌是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物 包括芽胞 使之呈无菌状态 经过灭菌的物品称 无菌物品 2 培养基灭菌 采用高压蒸汽灭菌 120 15 20分钟 培养基体积越大 灭菌时间越长 高温高压灭菌对培养基成分的影响 a pH值普遍下降 b 产生混浊或沉淀 这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀 例如Ca 2与PO4 3化合 就会产生磷酸钙沉淀 c 不少培养基颜色加深 d 体积和浓度有所变化 e 营养成分有时受到破坏 3 不耐高温材料的灭菌 采用过滤灭菌 如IAA ZT 天然有机添加物等 4 外植体的表面灭菌 采用70 75 乙醇 10 30秒 有效氯1 的次氯酸钠 5 30分钟 0 1 0 2 的氯化汞 2 15分钟 等杀菌剂中加入几滴吐温 20或80 Tween 20或80 效果较好 三 无菌操作 1 保持接种室的无污染环境 定期熏蒸或喷雾处理 接种前打开超净工作台及紫外灯照射20 30分钟 关闭紫外等灯后使气体散出后开始操作 2 保持超净工作台的洁净 接种前用70 乙醇擦拭台面或用喷壶喷雾 操作前 将手和手臂用70 乙醇消毒 所需试验用品用乙醇擦拭后放入超净工作台 3 点燃酒精灯 进行操作 接种材料前后 灼烧瓶口 工具要灼烧彻底 防止交叉污染 4 保持培养室的洁净 发现污染及时挑出 以减少污染源 5 操作中穿工作服 戴口罩 工作帽 出入接种室换拖鞋以保持接种室的洁净 第二章植物组织培养实验室的组成 仪器设备及基本操作 第一节实验室结构 仪器设备及操作技术一 植物组织培养实验室的结构及设计要求二 实验室基本操作 第二章植物组织培养实验室的组成 仪器设备及基本操作 第二节培养基的组成 配制与灭菌 一 培养基 medium 的组成和作用 通常植物组织培养所用培养基包括以下六大类成分 即矿质营养 有机成分 植物生长调节剂 碳源 琼脂以及其他附加物等 培养基的主要指标是 营养成分的浓度植物生长调节物质的浓度 一 矿质营养 矿质营养又称无机营养 是指植物生长发育所需要的各种化学元素 矿质元素的生理作用 1 组成各种化合物 成为结构物质 2 许多酶和附酶的组成部分 参与代谢 3 维持离子平衡 胶体稳定及电荷平衡等电化学作用 4 影响形态发生和组织 器官的建成等 根据植物对元素的吸收量 可以把植物必需元素分为大量元素和微量元素 国际植物生理学会规定植物所需浓度大于0 5mmol l的的元素称为大量元素 低于0 5mmol l的元素称为微量元素 大量元素 C H O N P K Ca Mg S分别占植物干重的百分数为18 10 70 0 3 0 07 0 3 0 3 0 07 0 05 微量元素 Fe B Mn Zn Mo Cu Co Cl等 1 大量元素 N P K Ca Mg S等6种大量元素依靠各种无机盐提供 不同植物种类和不同试验目的对元素的使用量要求不同 需经试验确定 目前已选择出多种培养基配方用于植物组织培养 其中以MS应用最广泛 以MS为例6中矿质元素分别由KNO3 NH4NO3 KH2PO4 MgSO47H2O CaCl24H2O提供 大量元素中的氮通常采用硝态氮或铵态氮 但铵态氮浓度过高会对有些植物的培养物造成伤害 不适宜使用过高的浓度 可以用谷氨酸 丝氨酸等来代替 2 微量元素 植物组织的对其需要量极少 过多会产生毒害 如造成蛋白质变性 酶失活 代谢障碍等 各种微量元素均具有特定的生理功能 如硼与蛋白质的合成及糖类的运输有关 铜能促进离体根的形成 锰参与植物的光合作用和呼吸作用 钼为氮素代谢的重要元素 微量元素中 铁的用量较大 它对叶绿素的合成起重要作用 由于在较高pH下 FeCl3极易形成Fe OH 3沉淀 难以被吸收 所以多用乙二胺四乙酸二钠盐与硫酸亚铁形成的螯合物 并且单独配制 二 有机成分 主要包括各种维生素和氨基酸常用的维生素 硫胺素 VB1 吡哆醇 VB6 烟酸 VB3 泛酸钙 VB5 生物素 钴胺素 VB12 叶酸等 常用的氨基酸 甘氨酸 谷氨酸 谷氨酰胺 丝氨酸 精氨酸 天冬氨酸 天冬酰氨 丙氨酸等 有时添加水解乳蛋白或水解酪蛋白 为牛乳经酶法加工的水解产物 含有20种氨基酸的混合物 用量10 1000mg L 通常用于原生质体等培养 此外肌醇是另外一种重要的有机成分 在维持离子平衡 糖类的转化中起重要作用 此外还参与磷脂代谢及等生理作用 它可以促进愈伤组织的形成 不定芽 不定胚的分化 三 植物生长调节物质 植物激素是植物代谢中产生的天然化合物 它能直接影响植物细胞的分化 分裂以及影响植物的形态建成 开花 结实 成熟 衰老脱落 休眠 萌发等生理活动 在植物组织培养中 主要通过植物激素及生长调节物质对离体的组织 器官的形态发生进行调控 包括诱导细胞分裂 愈伤组织的生长 根芽的分化以及体细胞胚胎发生等 常用的植物激素及生长调节物涉及五大类植物激素 1 生长素类 2 细胞分裂类 3 赤霉素类 4 脱落酸 5 多胺6 乙烯 1 生长素类 组织培养中的功能是 促进细胞伸长生长和细胞分裂 诱导形成愈伤组织 促进生根 常用的有NAA IAA IBA 2 4 D等 2 细胞分裂素类 功能 诱导芽的分化 促进侧芽萌发 促进细胞分裂和扩大 促进茎增粗 抑制茎伸长 延缓衰老 常用细胞分裂素有BA KT ZT 2ip等 此外近年来发现苯基脲衍生物具有非常高的细胞分裂素活性 在多种植物上应用 如TDZ CPPU 4 PU等 3 赤霉素类 主要具有诱导茎的细胞伸长 对根无效 对形成层细胞分化有影响 与生长素协同作用 可以诱导离体成花 打破休眠等功能 常用GA3 GA4等 4 脱落酸 ABA 促进休眠 衰老和脱落 组织培养中较少使用 主要用于种质资源的离体保存 5 乙烯 主要促进衰老和脱落 高浓度易形态变化 四 碳源 碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架 为细胞的呼吸代谢提供底物与能源 此外还能维持一定的渗透压 常用的碳源主要是蔗糖 使用浓度在10 50g L 此外果糖 葡萄糖 麦芽糖 山梨糖 甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物组织培养 五 琼脂 琼脂作为固化剂用于组织培养中 起支持植物的作用 不提供营养 为海藻中提取的一种高分子化合物 仅溶于热水 90oC以上 成为凝胶 冷却后 40oC以下 即凝固为凝胶 琼脂的用量通常在4 10g L 六 有机附加物 1 椰子汁 用量为100 200g L 2 香蕉泥 使用量为150 200g L 3 苹果汁 番茄汁等 七 其他成分 1 活性炭 使用量为0 2 1 2 抗生素 常用青霉素 链霉素 庆大霉素等 用量在5 20mg L 3 抑制酚类物质 抗坏血酸 4 生长抑制剂 常用矮壮素 比久 B9 多效唑 pp333 三碘苯甲酸 根皮酚等 二 培养基的类型 1 高盐浓度培养基 MS B5 SH等 适用于多数营养需求量较大的植物 2 低盐培养基 WPM White Nitsh等 适用于木本植物的培养 表3N6培养基的组成和配方 三 培养基母液及激素母液的配制 由于培养基中元素用量少 种类多 因此每次称量繁琐 因此通常将各种营养成分配制成母液保存 大量元素微量元素有机营养激素 1 器皿和用具的准备仪器包括万分之一天平 百分之一天平 pH计用品包括不同型号的烧杯 2000ml 1000ml 100ml 容量瓶 1000ml 500ml 100ml 移液管 10ml 5ml 2ml 1ml 试剂瓶若干 1000ml 250ml 移液器 1000ul 200ul 滴管 玻璃棒 试管 各种规格三角瓶 150ml 100ml 50ml 培养基分装器 漏斗 称量纸 标签纸 不同范围pH试纸 铅笔等 玻璃器皿用前清洗干净 2 药品及蒸馏水准备 药品采用分析纯或化学纯试剂 水利用蒸馏水或去离子水 3 母液配制 1 配制母液原则 相同类型的试剂混合 易形成沉淀的药品分开 母液浓度要适宜 用量要认真计算和核对 药品要准确称量 2 MS培养基母液的配制 MS培养基母液根据试剂特性通常配成四种母液 即大量元素母液 10或20倍 微量元素母液 100或1000倍 Fe盐 100倍 有机物 100倍 配置前先进行根据培养基组成和配制体积计算母液试剂用量 然后称取药品 大量元素可以用百分之一或千分之一天平 微量元素 铁盐和有机物用万分之一天平称量 3 激素母液的配制 根据各种激素的使用浓度配制适宜的母液 用万分之一天平称取激素 溶剂溶解后加水定容 生长素类 赤霉素类及脱落酸等用95 乙醇溶解 细胞分裂素类用1NHCl或1NNaOH溶解 通常激素母液浓度生长素类为0 1 0 5mg ml 细胞分裂素母液浓度为0 2 1 0mg ml 四 培养基的配制 量取母液 营养元素和激素 称量蔗糖 琼脂 放入600ml左右蒸馏水的锅内 电路上加热 使琼脂溶化 加入母液 混合均匀 调整pH值 四 培养基的配制 量取母液 营养元素和激素 称量蔗糖 琼脂 放入600ml左右蒸馏水的锅内 电路上加热 使琼脂溶化 加入母液 混合均匀 调整