植物组织MDA含量测定.doc

植物组织MDA含量测定一、目的要求1掌握植物组织MDA含量测定的原理及具体测量步骤；2深化理解MDA与逆境和衰老的关系，理解植物组织MDA含量测定的意义；3了解膜脂过氧化、氧自由基和MDA形成的关系；4能够根据待测材料的具体情况设计实验步骤测定MDA含量；5学习分光光度计，低温离心机等仪器的使用方法。二、实验原理植物遭受逆境胁迫或衰老时，体内会发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低，活性氧平衡失调及内源激素平衡失调等。活性氧代谢失调直接导致植物体内活性氧的大量积累，从而引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一个常用指标，可通过测定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。MDA在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA）反应，产生红棕色的产物3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮（Trimetnine），又名三甲川，该物质在532nm处有最大光吸收，在600nm处有最小光吸收。由于TBA也可与其它物质反应，并在532nm处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，同时测定600nm下的吸光度，利用532nm与600nm下的吸光度的差值计算MDA的浓度。即：A532A600CL式中，A532和A600分别表示532nm和600nm处的吸光度值，C是MDA浓度，L为比色杯厚度，=155Lmmol-1cm-1。TBA MDA 3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮需要指出的是，植物组织中糖类物质可能对MDA-TBA反应有干扰作用。可用下列公式消除由蔗糖引起的误差。 C（molL-1）=6.45(A532A600) 0.56A450三、材料与设备1材料：四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照。2仪器：(1) 分光光度计；(2) 冷冻离心机；（3）水浴锅；(4) 天平；(5) 研钵；(6) 剪刀；(7) 5ml刻度离心管；(9) 刻度试管(10ml)；(10) 镊子；(11) 移液管(5ml、2ml、1ml)；（12）冰箱。3药品(1) 0.05mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液；(2) 5三氯乙酸溶液：称取5g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，然后定容到100ml；(3) 0.5的TBA溶液：称取0.5g硫代巴比妥酸，用5三氯乙酸溶解，定容至100ml。四、实验步骤1MDA的提取：取样品0.5g（W），加入2ml预冷的0.05mol/L pH7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨成匀浆，转移到5ml刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗液也移入离心管中，最后用缓冲液定容至5ml。4500rpm，4度，离心10min，上清液即为MDA提取液，测量提取液的体积（V）。2MDA含量测定：吸2ml（V2）的提取液于刻度试管中（空白为2ml缓冲液），加入3ml 0.5的TBA溶液，将试管放入沸水浴中煮沸10 min（自试管内溶液中出现小气泡开始计时）。到时间后，立即将试管取出并放入冰浴中。4500rpm，4度，离心10min，取上清液并量其体积（V1）。上清液于532nm、600nm波长下测定吸光度。3结果计算:MDA(nmolg-1)6.452(A532A600) 式中，V1为反应液总量（ml）；V2为反应液中的提取液数量(ml)；V为提取液总量（ml）； W为植物样品重量(g)。五、实验报告样品处理重复A532A600MDA含量（nmolg-1）绿叶高温处理123平均标准差室温对照123平均标准差黄叶高温处理123平均标准差室温对照123平均标准差六、思考题1TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？2提取液与TBA的混合液为什么要加热？为什么加热时间又不能过长？3为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？4如果可溶性糖含量影响MDA含量的测定，你有什么办法消除其影响？5正常植物与衰老时相比丙二醛含量有什么变化，分析其原因。七、注意事项1可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要