安全生产_动物源食品安全现状及快速检测技术研究进展概述

动物源食品安全现状及快速检测技术研究进展 中国农业大学沈建忠2010年11月 主要内容 一 畜牧水产养殖业及动物源产品简况二 动物源食品安全现状三 食品安全监控相关法律法规四 有害化合物残留检测技术五 快速检测产品研制六 展望 中国是养殖业大国 其中 猪 60960万头奶牛 1300万头禽 120亿羽羊 28564 7万只 一 畜牧水产养殖业及动物源产品简况 中国又是动物源产品生产和消费大国 其中 肉类 7300万吨 人均达56kg 蛋类 2650万吨 人均达20kg 奶类 3650万吨 人均达28kg 水产品 4900万吨 人均达38kg 二 动物源食品安全现状 全球经济一体化和食品贸易国际化使食品安全成为一个世界性的挑战和全球重要的公共卫生问题 其中外源化合物 兽药 药物添加剂 违禁药物等 残留超过最高残留限量标准以及临床使用不遵守休药期是影响动物源食品安全的最主要因素之一 尽管世界各国采取了一系列政策和监控措施 但世界范围内涉及食品安全的恶性 突发事件时有发生 食品安全现状仍然令人担扰 我国目前食品检测数量仅占食品生产总量的1 5 且大多数为出口食品 国内消费食品检测比率极低 1 国外动物源食品安全事件 1972年墨西哥抗氯霉素伤寒杆菌1400人死亡 上世纪70年代意大利波多黎各玉米赤霉醇污染牛奶上千儿童性早熟 1995年日本O157 H7涉及44个都府县上万人中毒死亡11人 1996年英国疯牛病损失300亿美元 1999年比利时二恶英1000万只鸡被屠宰损失3 55亿欧元 1999年美国法国李斯特杆菌20人死 2000年日本大阪牛奶金黄色葡萄球菌14500人腹泻等80人住院强制召回 2001年英国口蹄疫迅速入侵欧洲大陆和南美洲 2003年欧洲甲孕酮污染猪饲料 2005年英国苏丹红事件 2006年美国毒菠菜事件大肠杆菌污染造成26个州200余人感染 其中3人死 2008年日本水银大米水银污染田种植水稻出售 2009年美国花生酱事件花生酱和花生糊被沙门氏菌污染 造成636人感染 至少9人死亡 2009年加拿大李斯特杆菌事件1人死 2 国内动物源食品安全事件 1987年上海毛蚶甲肝30万市民感染 1997年香港禽流感事件 1998江西食用装过有机锡油桶中的猪油200多人中毒3人死亡 1999年8月至2000年1月化学物或微生物污染出口到美国的634批食品遭销毁 农畜产品农药残留超标2001年24个省 市 自治区调查食品中农药残留超标率高达18 5 2001年苏皖等省肠出血性大肠杆菌O157 H7污染食物引起2万余人中毒177人死亡 2002年广西柳州市78人食用有机磷农药超标菜花中毒事件 上世纪90年代畜产品和水产品出口欧盟 日本等屡屡受阻 2002年SARS食用野生动物 动物产品 瘦肉精 残留事件常年发生上万人中毒 2003年广西等地猪肉氯霉素残留事件 2003年山东禽肉查出含呋吗唑酮和呋喃唑酮残留出口瑞典的遭封杀 2005年以来禽流感 2005年出口香港水产孔雀石绿 2006年上海多宝鱼事件和河北红心鸭蛋事件 2007年山东多宝鱼事件 2008年出口日本禽产品硝基呋喃代谢物残留事件 2008年三鹿奶粉事件 2009年2月浙江多省63名婴儿多美滋婴儿配方奶粉肾结石 2009年4月浙江晨园乳业皮革水解蛋白 2009年12月上海熊猫乳品有限公司因三聚氰胺超标被查处 2010年1月贵州发现山东淄博绿赛尔乳业有限公司 辽宁省铁岭五洲食品有限公司和河北唐山乐亭县凯达冷冻厂生产的奶制品含有过量的三聚氰胺 从1997年至2007年 中国农产品外贸因食品安全绿色 技术 壁垒而受阻的产品总值超过2000亿美元 1997年香港禽流感 内地损失2亿多元 香港损失5000多万元 2002年出口欧盟水产品因氯霉素残留事件遭全面禁运造成损失6亿多美元 2004年山东出口禽肉因磺胺二甲嘧啶残留超标造成损失1 3亿元 2007年山东多宝鱼事件损失40亿元 2008年三聚氰胺损失 细菌 如沙门氏菌 弯曲菌 李氏杆菌等 病毒 如禽流感等 寄生虫 如旋毛虫等 化学污染 兽药残留 包括允许使用和禁用品种 农药残留 有机磷 有机氯等 环境污染物 如多氯联苯等 重金属 如铅 镉等 霉菌毒素 如玉米赤霉醇等 非法添加物 如三聚氰胺 皮革水解蛋白等 包装材料 生物污染 在养殖源头 如饲料 饲养环境 饲养过程及产品运输 加工过程中出现 3 产生动物源食品安全问题的主要原因 猪及其产品残留主要品种 兴奋剂类 如克仑特罗 沙丁胺醇 莱克多巴胺等镇静药物类氯霉素喹诺酮类 如恩诺沙星 环丙沙星等磺胺类 如磺胺二甲嘧啶等四环素类 如土霉素 金霉素等 鸡及其产品残留主要品种 硝基呋喃类 如呋喃唑酮 呋喃它酮等氯霉素喹诺酮类 如恩诺沙星 环丙沙星等磺胺类 如磺胺二甲嘧啶等四环素类 如土霉素 金霉素等激素类 肉牛及其产品残留主要品种 兴奋剂类 如克仑特罗 沙丁胺醇 莱克多巴胺等玉米赤霉醇类喹诺酮类 如恩诺沙星 环丙沙星等 奶牛及奶制品残留主要品种 三聚氰胺 内酰胺酶霉菌毒素 内酰胺类 青霉素类和头孢类 如青霉素 阿莫西林 氨苄西林 氯唑西林 头孢喹肟 头孢噻呋等 兴奋剂类 如克仑特罗 沙丁胺醇 莱克多巴胺等喹诺酮类 如恩诺沙星 环丙沙星等氨基糖苷类 如链霉素 庆大霉素等磺胺类 如磺胺二甲嘧啶等四环素类 如四环素 土霉素 金霉素等氯霉素激素类 4 残留危害 对人类健康的直接危害中毒 过敏 激素样作用 肠道菌群紊乱等对人类健康的间接危害动物源耐药病原菌沿食物链的传递 扩散对动物疾病防治的影响动物病原菌耐药性上升对环境的影响土壤中的蠕虫 微生物 水环境中的藻类 微生物 三 食品安全监控相关法律法规 中华人民共和国动物及动物源食品中残留物质监控计划 官方取样程序 兽药管理条例 饲料和饲料添加剂管理条例 动物源食品中兽药最高残留限量 饲料药物添加剂使用规范 食品动物中禁止使用的化合物清单 中国从1999年开始残留监控工作 先后发布以下法律法规 禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录 国家兽药残留基准实验室药物残留检测范围 兽药停药期规定 中华人民共和国兽药典 中华人民共和国农产品质量安全法 中华人民共和国食品安全法 农业部235号公告中颁布了109种兽药的限量标准 涉及马 牛 羊 猪 禽 蜜蜂 鱼 虾等动物 样品有组织 肌肉 肝脏 肾脏 脂肪等 牛奶 蜂蜜等 农业部193号公告颁布了21种食品动物禁用的兽药及其它化合物清单 牛奶及奶制品中兽药残留限量 农业部193号 食品动物禁用的兽药及其它化合物清单 已发布兽药残留检测方法标准超过1000个 从2001年开始实施兽药残留监控计划 各省 市 也相应制定并实施地方残留监控计划 以2009年度农业部动物性产品中兽药残留监控计划为例 抽检动物包括牛 猪 羊 鸡 水产和蜂 抽检产品有牛奶 肉 肝 蜂蜜等 其他还有尿样 已发布兽药残留检测方法标准超过1000个 从2001年开始实施兽药残留监控计划 各省 市 也相应制定并实施地方残留监控计划 以2009年度农业部动物性产品中兽药残留监控计划为例 抽检动物包括牛 猪 羊 鸡 水产和蜂 抽检产品有牛奶 肉 肝 蜂蜜等 其他还有尿样 1 鸡组织中兽药残留监控计划 2 牛奶中兽药残留监控计划 3 羊组织中兽药残留监控计划 4 猪组织中兽药残留监控计划 5 蜂蜜中兽药残留监控计划 6 水产品中兽药残留监控计划 化学物及代谢物 分离纯化 监控 兽药等化学物 样品 检测方法 快速检测方法仪器确证方法 固相萃取技术基质固相分散技术免疫亲和色谱技术分子印迹技术超临界萃取技术 四 有害化合物残留检测技术 微生物抑制测定法酶联免疫吸附测定法量子点标记荧光检测法荧光偏振免疫检测法化学发光免疫检测法放射免疫测定法金标试纸条生物传感器生物芯片 1 快速检测方法 荧光偏振免疫分析技术 荧光偏振免疫分析 Fluorescencepolarizationimmunoassay FPIA 是竞争性的均相免疫分析方法 就是检测荧光标记抗原 tracer 在结合特异性的抗体前后 荧光偏振值 FP 值的变化 不需要分离结合的和未结合的抗体 经过几分钟甚至是几秒钟的温育便可直接测量 很快得到被测药物的浓度 实验的时间仅仅决定于加样的时间 FPIA是竞争性的均相免疫分析 抗原浓度低FP值高 抗原浓度高FP值小 P 荧光素与磺胺二甲基嘧啶偶联 SM2 FITC TLC分离纯化 几种兽药检测分析结果 FluorescencePolarizationImmunoassayforSalinomycinBasedonMonoclonalAntibody ScienceChina Chemistry 2010 53 553 555Determinationofveterinarydrugmaduramicininfoodbyfluorescencepolarizationimmunoassay InternationalJournalofFoodScienceandTechnology 2008 43 114 122 Simultaneousdeterminationofsulphamerazine sulphamethazineandsulphadiazineinhoneyandchickenmusclebyfluorescencepolarisationimmunoassaybasedonmonoclonalantibody 2008 FoodAdditivesandContaminants 25 5 574 582 MonoclonalAntibody BasedFluorescencePolarizationimmunoassayfortheveterinarydrugSulfamethoxypyridazineandSulfachloropyridazineinMilk JournalofAgricultureandFoodChemistry 2007 55 17 6871 6878 Fluorescencepolarisationimmunoassaybasedonamonoclonalantibodyforthedetectionofsulfamethazineinchickenmuscle InternationalJournalofFoodScienceandTechnology 2007 42 36 44荧光偏振免疫分析检测磺胺二甲基嘧啶残留研究 分析化学 2007 35 6 819 824 发表文章 时间分辩免疫分析技术 时间分辨荧光免疫分析 TrFIA 是利用镧系络合物作为标记物的免疫分析技术 其络合物具有荧光寿命长 激发光谱带较宽 发射光谱带甚窄和Stokes位移大等特点 可以消除背景荧光的干扰 有效提高检测方法的灵敏度 双抗夹心TR FIA反应原理示意图 氯霉素莱克多巴胺 发表文章 Amonoclonalantibody basedtime resolvedfluoroimmunoassayforchloramphenicolinshrimpandchickenmuscle AnalyticaChimicaActa 2006 575 2 262 6Time resolvedFluoroimmunoassayforRactopamineinSwineTissue JournalofAgricultureFoodandChemistry 2007 387 1561 1564 化学发光免疫分析技术 化学发光免疫分析 CLIA 一般分为两种模式 第一种是以发光剂作为酶免疫测定的底物 通过发光反应增强测定的敏感性 第二种是以发光剂作为抗体或抗原的标记物 直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的含量 Cl ELISA与传统ELISA灵敏度比较 Cl ELISA ELISA DevelopmentofaChemiluminescentELISAforDeterminingChloramphenicolinChickenMuscle JournalofAgricultureFoodandChemistry 2006 54 16 5718 5722 化学发光免疫检测氯霉素 量子点标记免疫分析技术量子点 quantumdots QDs 又称半导体纳米微晶体 是一种由II VI族或 V族元素组成的 直径约为1 100nm 能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒 量子点表面结构经过修饰 借助于其外端的羧基 能与生物分子的氨基相结合 如抗体等偶联 发表文章 1 Simultaneousdetectionofmultiplechemicalresiduesinmilkusingbroad specificityantibodiesinahybridimmunosorbentassay Biosens Bioelectron 2010 aheadofprint2 Characterizationandapplicationofquantumdotnanocrystalmonoclonalantibodyconjugatesforthedeterminationofsulfamethazineinmilkbyfluoroimmunoassay 2007 AnalBioanalChem 389 2243 2250 3 Theapplicationofquantumdotantibodyconjugatesfordetectionofsulfamethaz ineresidueinchickenmuscletissue 2006 JAgrFoodChem 54 17 6139 6142 4 量子点的应用 种新型的荧光定量检测技术 中国兽医杂志 2007 43 6 69 70 2 仪器分析方法 气相色谱法 GC 高效液相色谱法 HPLC 原子荧光法 AF 原子吸收法 AA 气谱 质谱法 GC MS 气谱 串联质谱法 GC MS MS 液谱 质谱法 LC MS 液谱 串联质谱法 LC MS MS 各种测定方法的灵敏度范围 有害化合物残留检测 先用快速检测产品进行筛查 可疑阳性样品再用仪器分析方法尤其是色质联用检测方法加以确证 美国 欧盟 日本等均采用此策略 抽检数量超过总样品数的10 1 快速检测产品种类 试剂盒试纸条生物传感器免疫芯片快速检测仪检测箱 目前主要的快速检测产品包括 五 快速检测产品研制 2 小分子抗体制备技术 目前抗体种类主要是多抗和单抗替代抗体 基因重组抗体 纳米抗体 核酸适配体 抗转运蛋白 受体 分子印迹聚合物等均有相关研究 核酸适配体 抗转运蛋白 兽药分子量大都小于1000 药物本身没有免疫原性 必须经过结构改造后与大分子载体蛋白结合才能产生有效抗体 半抗原 信息含量丰富的半抗原合理设计 小分子 结构优化 计算化学 性质参数 物化 电量 空间等信息 最佳半抗原 免疫动物 抗体 合适抗原表位 间隔臂 最佳半抗原 统计分析 应用量子力学AM1 得到了磺胺类和玉米赤霉醇类药物的物化 电性 疏水性等性质 从分子水平比较各药物与半抗原的异同 化学学报 2008 66 2613 2619 为半抗原合理设计提供了方法指导 SM2化学结构 SM2最低能量构象 SM2最高占据轨道 HOMO 和最低未占据轨道 LUMO 玉米赤霉醇类药物的三维构象和电荷分布 玉米赤霉醇类药物的结构信息 ZHWang JZShen 2009 JournalofMolecularRecognition submitted 疏水性 体积 偶极距 分子距离 电量 相关系数 获得的分子结构信息 已用于半抗原的合理设计 单克隆抗体制备过程 脾细胞 杂交瘤细胞 基因重组抗体制备 噬菌体展示抗体库淘选策略 scFv 抗体评价及指导抗体定向改造 受体抗体 Acceptor UniSenesor公司研发了基于受体的可同时检测13种青霉素和四环素两类药物的试纸条产品中国农大和北京维德维康公司合作研发可同时检测15种青霉素和头孢类药物的试纸条产品 受体作为特异性识别的生物大分子 因其分离纯化及体外构建均较复杂 应用于免疫分析的报道很少 TwinSensorBT 放射性受体分析法1978年美国波士顿大学教授Charm发明 受体分析法 CHARMI是专用于牛奶中 一内酰胺抗生素残留检测方法 也是美国AOAC承认的第一个快速测定法 这个方法非常快速和灵敏 一个奶牛样品分析只需15分钟时间 目前 CHARM被多国政府的农业部和卫生部采用作为的标准方法如我国 四环素类 SN T2309 2009 内酰胺类 GB T21174 2007 磺胺类 GB T21173 2007 细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合 进而引起生物学效应的特殊蛋白质 微孔板检测系统基于膜的检测系统表面等离子共振传感器 侧流层析技术 免疫渗滤技术 荧光分析系统 CHARM原理 受体分析法的优势 可以检测同一类抗生素难点 受体的制备 检测方法的应用 目的基因的调取 目的蛋白活性鉴定 目的蛋白的表达及纯化 表达载体的构建 基于受体的快速检测方法建立 检测方法的优化 青霉素等 内酰胺类抗生素通过与细菌膜蛋白结合 抑制细菌细胞壁的生物合成 引起细菌细胞死亡从而发挥杀菌作用的 这种细菌蛋白被命名为青霉素结合蛋白 Penicillin BindingProtein PBP 2001年发现了肺炎链球菌野生R6株5个编码明确的青霉素结合蛋白的基因 其中PBP2x对青霉素类和头孢类抗生素都具有很高的敏感性 青霉素结合蛋白识别 内酰胺药物列表 基本原理目前常用的主要为ELISA试剂盒 在测定时 把受检标本 测定其中的抗体或抗原 和酶标抗原或抗体与固相载体表面的抗原或抗体起反应 结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量有一定的比例 加入酶反应的底物后 底物被酶催化变为有色产物 产物的量与标本中受检物质的量直接相关 根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析 1 试剂盒 3 试剂盒 试纸条研制 1 加入待测物 2 加入抗体 3 加入酶标二体 4 加入底物 5 加入终止液 目前试剂盒最常用方法为间接竞争ELISA法 其他还用直接法 夹心法等 优点灵敏度高 特异性强 可进行定性和定量测定检测方便 快捷 一般1 2个小时就能出结果对操作者和实验室条件要求不高可以用于大量样本的快速筛选 试剂盒组成 试剂盒检测需要的仪器 恒温摇床 离心机 恒温培养箱 涡动仪 酶标分析仪 移液枪 试剂盒检测所需试剂 主要用于复杂样品 如肌肉 肝脏等 的前处理 大多为常规有机或无机溶剂 1 甲醇2 乙腈3 乙酸乙酯4 磷酸盐缓冲溶液5 由低到高的标准溶液 用于绘制标准曲线 阳性添加样品孔 阴性添加样品孔 实测样品区 最多可检测40个样品 酶标板实际检测布局 试剂盒一般操作步骤 1 向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液 再加入一抗 用盖板膜封板 37 恒温箱中孵育 2 倒出孔中液体 加入浓缩洗涤液 30s后倒出孔中液体 如此重复操作 用吸水纸拍干 3 加入酶标二抗 37 恒温箱中孵育 4 倒出孔中液体 重复洗涤步骤 5 加入底物显色液A液 底物显色液B液 轻轻振荡混匀 37 恒温箱避光显色15min 6 加入终止液 轻轻振荡混匀 7 用酶标仪 测定每孔吸光度值 结果判定 标准曲线法 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值 B 除以第一个标准 0标准 的吸光度值 B0 再乘以100 即百分吸光度值 百分吸光度值 B B0 100 B 标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0 0 g L标准溶液的平均吸光度值 以检测标准浓度 g L 的自然对数值为X轴 百分吸光度值为Y轴 绘制标准曲线图 相对应每一个样品的浓度 g kg 可以从标准曲线上读出 也可以用回归方程法 计算出样本溶液浓度 利用计算机专业软件 更便于大量样品的快速分析 1 试纸条结构 基本原理采用竞争法 样品滴入后 在层析作用下经胶体金标记抗体的结合垫 再流经包被抗原和二抗的T线和C线 若样品中含有药物 药物与金标抗体结合后不再与抗原反应 T线不显色 若不含药物 则金标抗体与抗原反应 T线显色 无论有无药物 二抗与金标抗体均反应 即C线显色 2 试纸条 优点灵敏度高 特异性强检测方便 快捷 一般3 5分钟就能出结果几乎不需要任何仪器设备可用于大量样本的快速筛选 适用于现场检测 试纸条组成 试纸条的一般检测步骤 1 样品前处理对牛奶 蜂蜜 尿液等样品 只需进行简单稀释即可 对猪肉等样品 通过提取或加热处理后 进行稀释 2 取出试纸条 平放到桌面上 用一次性吸管吸取样品处理液 在加样孔中加入4滴 3 5min后观察结果 4 结果判定 阴性 C线显色 T线有颜色 无论颜色深浅均判为阴性 阳性 C线显色 T线无颜色 判为阳性 无效 C线不显色 无论T线是否有无 该试纸条均判为无效 结果判定 4 生物传感器 生物芯片研制 原理 待测物质经扩散作用进入生物活性材料 经分子识别 发生生物学反应 产生的信息继而被相应的物理或化学换能器转变成可定量和可处理的电信号 再经二次仪表放大并输出 便可知道待测物浓度 生物传感器 免疫传感器可以实现在线化和即时化 目前应用于小分子化合物检测的主要是光学生物传感器 表面等离子体谐振 SPR 传感器 由瑞典BIACO