Y染色体微缺失检测试剂盒颜色补偿实验操作说明书.doc

Y染色体微缺失检测试剂盒颜色补偿实验操作说明（适用于Roche Lightcycler 480机型）【反应液配制】如下表所示，按照管号1-5分别配制5份不同的反应液，每份反应液配6个平行管。每个反应管含有22.8 L的反应预混液，0.2 L Taq酶（管号6）以及2 L阳性对照品（管号7）。如反应于96孔板中进行，请按下图所示进行反应液的板位分布排列。（注：平行管反应液应统一配置后，再分装为6管，每管25 L）反应液内容物反应板位反应液1空白预混液（管号1）+Taq酶+阳性对照B2-G2反应液2FAM预混液（管号2）+Taq酶+阳性对照B4-G4反应液3HEX预混液（管号3）+Taq酶+阳性对照B6-G6反应液4ROX预混液（管号4）+Taq酶+阳性对照B8-G8反应液5CY5预混液（管号5）+Taq酶+阳性对照B10-G10反应液3反应液2反应液1反应液4反应液5【软件设置】1、 打开主界面，在右侧工具栏中选择“open tools”。打开后，在页面中选择“Detection Formats”，新建一个程序，并命名，如“YDEL”，然后在“Filter Cominarion Selection”中设置所需要的荧光通道波长，并保存，如下图所示：2、回到主界面，在右侧工具栏中选择“New Experiment”，新建一个实验，在“Detection Formats”菜单中，选择上一步所设检测模式，如“YDEL”；然后，点击右侧“Cutomize”，如下图所示：3、点击“Cutomize”后，打开以下界面，选择“Dynamic”，确认4个荧光通道全部打“”，并保存，如下图：4、将配制好的样本按要求放入第2、4、6、8、10排，分别对应不同的荧光通道，如下图所示：反应液3反应液2反应液1反应液4反应液55、放置样本后，进行实验程序设置，如下表和图所示：体系总体积为 25 微升（l）分析模式核酸扩增反应阶段条件循环数预变性95； 3分钟（min）1PCR95； 15秒（sec） 40 Quantification61； 20秒（sec）采集72； 20秒（sec）熔解曲线分析变性95； 1秒（sec）1复性40； 30秒（sec）1熔解曲线分析 40 升温至66；升温速率 0.03/秒；荧光采集次数5 次/秒。1Color Compensation仪器冷却50； 30秒（sec）16、保存程序后，点击“Start Run”开始运行程序，并保存文件名。7、在运行界面左侧，选择“Subset Editor”，点击下方“”号，新建一个子集，命名为“color compensation”，如下图选择进行颜色补偿实验的反应孔后点击“Apply”。8、在运行界面左侧，选择“Sample Editor”，在“Select Workflow”中选择“Color Comp”，如下图所示；选择相同反应液的6个平行管，并在“Dominant Channel”中，选择与相应的反应管相对应的荧光通道的波长。第2排: Water；第4排: FAM 465-510; 第6排: HEX 533-580; 第8排: ROX 533-610; 第10排: Cy5 618-660。9、程序运行结束后，点击界面左侧“Analysis”，选择“Abs Quant/2nd Derivative Max”，进入界面后，点击“Filter Comb”分别查看四个荧光通道的扩增情况，均应有扩增。如下图所示：8、点击界面左侧“Analysis”，选择“Color Compensation”，在Subset选项中下拉选项框，选择“color compensation”；进入界面后，选中进行颜色补偿实验的通道，点击“Calculate”；然后，点击右下角“Save CC Object”，将文件保存在“Special Date”文件夹下的“CCC”文件夹中，如文件“YDEL Color Compensation”。具体操作如下图所示：【颜色补偿的使用方法】在进行Y染色体微缺失检测实验时，运行程序结束后，点击界面左侧“Analysis”，选择“Abs Quant/2nd Derivative Max”。进入界面后，点击下方“Color Comp（off）”下拉选项框，选择“In Database”，在路径中选择已保存的颜色补偿文件，如“YDEL Color Compensation(CC)”；跳出选项框“Color Compensation Channels”