葛根提取物样品中总黄酮和葛根素含量的测定.doc

葛根提取物样品中总黄酮和葛根素含量的测定一、 实验背景介绍1. 黄酮类化合物的定义、结构与分类黄酮类化合物是在植物中分布非常广泛的一类天然产物。此类化合物多为黄色，且具有酮式羰基，故称黄酮类化合物。1952年以前，黄酮类化合物主要是指基本母核为2-苯基色原酮的一系列化合物。峰带II，220280 nm A环苯甲酰基系统峰带I，300400 nm B环桂皮酰基系统色原酮 2-苯基色原酮（黄酮）现在的黄酮类化合物则泛指两个苯环（A与B环）通过中央三碳链相互连接而成的一类化合物。 C6-C3-C6黄酮类化合物的苷元的结构类型根据三碳链氧化程度、B环（苯基）连接位置（2-位或3-位）以及三碳链是否构成环状可分为黄酮、异黄酮、二氢黄酮、查尔酮、花色素、橙酮类、黄烷醇类等。2.葛根及其所含黄酮的功能介绍葛根为豆科植物野葛的干燥根，其味甘、辛、性平，既是中药材又是营养丰富的食用原料。葛根是我国一种传统中药，对于葛根的药用价值早在神农本草经中就有记载，葛根具有解痉退热、生津、透疹、升阳止泻等功能。黄酮类化合物是葛根中的主要活性类成分之一，同其它大多数黄酮类化合物相似，葛根黄酮类化合物也具有多种药理功能，如改善血液循环、降血压、降血糖、降血脂、抑制动脉硬化，抗心率失常，抗血小板聚集、抗肿瘤、抗缺氧与抗氧化等。此外，葛根目前己被卫生部认定为药食两用的山地植物。葛根素是从葛根中所提取得到的一种异黄酮类化合物，是葛根总黄酮中的一种。实验证明其有扩张心脑血管，降低心肌氧耗，改善心肌收缩功能和促进血液微循环作用，可用于治疗冠心病、视网膜动、静脉阻塞和突发性耳聋等微循环障碍病。基于上述显著的药用价值，对葛根提取物中总黄酮以及葛根素含量的测定具有重要的意义。二、实验目的：1. 了解双光束紫外可见分光光度计和高效液相色谱的基本结构，并掌握相应的基本操作2. 能够通过化合物的紫外光谱扫描曲线，选择合适的测定波长3. 掌握高效液相色谱法定性定量分析的基本原理4. 学习葛根提取物中总黄酮和葛根素的测定方法三、实验原理1. 总黄酮含量的测定原理大多数黄酮类化合物分子中存在桂皮酰基和苯甲酰基组成的交叉共轭体系，其在200400 nm波长的区域内存在两个紫外吸收带，即位于带(300400 nm)和带(240280 nm)。其中带的吸收峰较强，是定量分析的重要依据，可采用紫外分光光度法测定样品中总黄酮类化合物的含量。由于葛根素是葛根中含量较多且具有代表性的一种黄酮，因而常以其为参考标准来测定葛根及其附加产品中总黄酮的含量。2. 葛根素含量的测定原理葛根提取物中的组份较多，具体到葛根素的测定，则首先应将其与其他组分分离开来再进行测定，而高效液相色谱法是天然产物分离分析的重要手段，可通过优化色谱操作条件实现葛根素的分离和测定。根据色谱定性原理，即同一种物质在相同色谱操作条件下的保留时间一致，通过与葛根素标准品保留时间的对比，来确定提取物色谱图中的葛根素色谱峰。根据色谱定量分析的原理，即在相同的色谱操作条件下，色谱峰的峰面积与待测物质的浓度成正比，依此可测定葛根素系列标准溶液的峰面积，绘制标准曲线，再由提取物溶液中葛根素的峰面积求出相应的浓度，最终计算出提取物中葛根素的含量。四、 主要仪器与试剂主要仪器：TU-1901型双光束紫外可见分光光度计；Thermo Fisher UltiMate 3000高效液相色谱仪（配有UV检测器和chromeleon色谱工作站），分析天平；超声波清洗器。主要试剂：1.0 mg/mL葛根素标准储备液（体积比为30/70的乙醇水做溶剂）；葛根提取物A；葛根提取物B；甲醇（色谱纯）；无水乙醇（分析纯）；超纯水 五、实验步骤1. 葛根提取物中总黄酮含量的测定（1）精密量取0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 mL的葛根素标准储备液至于100 mL容量瓶中，用30%的乙醇水溶液稀释至刻度，摇匀。（2）精密称取10 mg葛根提取物A，将其转移至50 mL的容量瓶中，用30%的乙醇水溶液稀释至刻度，摇匀，之后再精密量取0.50 mL溶液至于10 mL容量瓶中，用30%的乙醇水溶液稀释至刻度，摇匀，以上步骤平行三次。对葛根提取物B做相同处理。（3）用紫外分光光度计扫描葛根素标准样品溶液的吸收曲线（浓度可随机选取），确定最大吸收波长，然后采用定量测量的方式，测定系列标准溶液的吸光度，绘制标准曲线。（4）测定步骤（2）中葛根提取物A和B最终稀释样品的吸光度，取平均值，再对比标准曲线图，得出相应的浓度，最后分别计算两种葛根提取物中总黄酮的含量。二、葛根提取物中葛根素的含量测定（1）精密量取0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 mL的葛根素标准储备液至于10 mL容量瓶中，用10%的甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀。（2）精密称取10 mg葛根提取物A，将其转移至100 mL的容量瓶中，用10%的甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，对葛根提取物B做相同处理。（3）用高效液相色谱对配制的葛根素标准溶液进行测定，绘制标准工作曲线，（4）用高效液相色谱对步骤（2）中葛根提取物A和B溶液进行测定，对图中的葛根素色谱峰进行定性定量分析。六、结果与讨论（1）葛根素标准品溶液的光谱扫描曲线，说明检测所需要的波长（2）葛根素标准工作曲线的绘制（紫外），并以此工作曲线为标准，计算出葛根提取物A和B中的总黄酮含量（3）葛根提取物中葛根素含量的定性分析，即根据所得到的色谱图，说明提取物A和B的色谱图中那个峰代表的葛根素 （根据保留