制备葵花籽降压肽脂质体.doc

冷冻干燥法制备葵花籽降压肽前体脂质体1、 冻干保护剂的选择药品冷冻干燥是一个多步骤过程，会产生多种应力使药品变性，如低温应力、冻结应力和干燥应力。其中冻结应力又可分为枝状冰晶的形成，离子浓度的增加，PH值的改变和相分离等情况。因此，为了保护药品的活性，通常在药品配方中添加活性物质的保护剂。在冻干脂质体中,冻干保护剂需要满足两个要求:产品外观上应饱满致密,可以形成有一定硬度的饼状物;需要有玻璃态存在,保护脂质体膜不致受到结晶的机械破坏。常用的保护剂有如下几类物质，糖类/多元醇：蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖等聚合物：HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白等无水溶剂：乙烯乙二醇、甘油、DMSO、DMF等表面活性剂：Tween 80等氨基酸：L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等盐和胺：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等 本实验对常用的几种冻干保护剂甘露醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖进行了考察2、 葵花籽降压肽脂质体的制备方法一0.降压肽制备：提蛋白=碱性蛋白酶1h（ph 9-10）=风味蛋白酶1h（ph7）=灭 酶=离心（8000，20-30min）=取上清液=测含量=计算多肽的量1. 按合适的质量比取适量的冻干保护剂，用pH6.5的磷酸缓冲液溶解,置恒温水浴中备用.（具备）2. 另取适量葵花籽降压肽（1：20磷脂）、PEG（磷脂的5%）、大豆磷脂及胆固醇（4：1）加入少量无水乙醇（）中,水浴加热（40，30min保温）溶解,配成脂质溶液。3. 将冻干保护剂溶液倒人脂质液中,振荡混匀,于超声波探头中进行超声波破碎，取出后冷冻保存，冷冻干燥8小时。4. 包埋率测定Determination of entrapment efficiencyThe amount of unassociated peptides (W1) was determined according to Panico et al (1993) with some modifications, by reaction of the supernatant solution obtained from centrifugation (10,000g, 30min) with Cu2+ and bicinchoninic acid (BCA), and evaluation of absorbance increase at 562 nm. Empty liposomes were used as blank cuvettes in order to correct for turbidity effect. A standard working curve was constructed from bovine serum albumin (BSA). The incorporation of peptides (W2) into liposomes after the two washing cycles was added some methanol in order to disruption liposome wall, and calculated by the difference from the initial amount of peptides added. The %entrapment was calculated according to the following equation: % entrapment = W2/(W1+W2)100.Panico, A.M., Pignatello, R., Mazzone, S., Cardile, V., Bindoni, M., Cordopatri, F., Villari, A., Micali, N. and Mazzone, G. (1993) Lipid vesicles loaded with thymopentin: characterization and in vitro activity on tumoral cells. Int. J. Pharm. 98, 19-28.5. （选取影响脂质体载药量的5个主要因素：PEG添加量、葵花籽多肽（g）与大豆磷脂（g）的比值（A）、磷脂和胆固醇比（B） 和超声波处理强度（C）、超声波时间（D）等）取葵花籽降压肽前体脂质体,加人lml水充分混匀,即可得到葵花籽降压肽脂质体。前体脂质体是将脂质体膜材、药物和适宜附加剂用适当的方法制成的一种前体制剂,当加水或药物水溶液稀释或水化时即能转化为脂质体。方法二反相蒸发法 称取一定量的大豆卵磷脂和胆固醇，溶于乙醚得到透明澄清的类脂溶液；称取配方量的葵花籽降压肽溶于 PBS 中；将葵花籽降压肽的 PBS 溶液加入类脂溶液中，将两者的混合液在冰浴中短时超声 5min（间歇超声，1s/1s），得乳状液，在 40水浴中旋转蒸发除去乙醚（真空度以不爆沸为主），待乳状液在烧瓶壁上形成均匀的薄膜后，加入一定量的 PBS，继续旋转蒸发水合 30min 除去剩余的乙醚，所得牛奶状混悬液即为脂质体。置于 4冰箱贮藏。方法三乙醚注入法 1. 称取配方量的葵花籽降压肽，溶于 PBS 中，形成溶质溶液，于 60水浴中充分搅拌；2. 称取配方量的大豆卵磷脂和胆固醇，溶于乙醚中，形成脂质溶液，用注射器将其匀速注入溶质溶液中，保温 30min，脂质体形成；3. 将上述脂质体在冰浴中短时超声 5min（间歇超声，1s/1s），即得脂质体。置于 4冰箱贮藏。参考量：大豆卵磷脂 200mg，胆固醇 50mg，降压肽50mg，水合时间 30min，水合温度 40（因乙醇沸点较高，故乙醇注入法的水合温度为 60），缓冲液体积 10mL，超声时间 5min（间歇作用，1s/1s）,超声强度 280W。 冷冻干燥法制备葵花籽降压肽前体脂质体 前体脂质体首先是由 Payne 等提出的。所谓前体脂质体是将构成脂质体的膜材、芯材及其他的附加剂用适当的方法制成一种前体制剂，使用前加水或芯材水溶液稀释或水化即能重建为脂质体。见报道的前体脂质体可分为三类：混合胶团前体脂质体、液晶前体脂质体和干颗粒前体脂质体，前两种呈液态，后一种为固态，他们均比相应的脂质体稳定。其中固态前体脂质体是研究的最多也最有前途的一种，由于其处于干燥状态，可解决普通脂质体的聚集、沉降、芯材渗漏及磷脂氧化等稳定性问题及灭菌问题，使其向工业化迈出了关键的一步，另外还便于贮存和运输。前体脂质体的制备方法主要有喷雾干燥法和冷冻干燥法。喷雾干燥法成本低、生产周期短，但其工作温度高，不太适用于热敏性物质（如蛋白质）的包埋，而且也会引起磷脂的氧化。为了保持脂质体冻干前的结构和功能，冻干保护剂的种类和浓度是首要考虑的因素。虽然许多保护剂如糖类、蛋白质类、氨基酸类等都显示出对脂质体的冻干过程中具有一定的保护作用，但发现多糖类和多元醇类效果优于其他类保护剂。单糖、双糖、寡聚糖、多糖、多元醇、水溶性大分子等是经常使用的一类保护剂。 前体脂质体的制备、真空冷冻干燥（vacuum freeze-drying），即冻干，将体系在共熔点以下预冻，在低温低压下，从冻结状态不经过液态而直接升华除去水分，具体包括：预冻、升华干燥（第一阶段干燥）、解吸干燥（第二阶段干燥）。 按照制备脂质体方法进行葵花籽降压肽脂质体的制备，葵花籽降压肽脂质体的水相溶液中溶解不同浓度的各种糖类物质，其余操作均相同，制备得到葵花籽降压肽脂质体悬浮液。准确吸取脂质体 1 mL，转移装于 5 mL 的西林瓶中。样品首先预冻至-60 ，进行一次干燥过程，维持样品温度低于-40 ，压力 5 Pa，时间 48 h，直到样品中升华界面全部消失。升温至 20 ，进行二次干燥过程，时间 10 h，冻干过程结束。冻干样品避光，常温保存于干燥器中。3、 包封率的测定包封率是评价脂质体包埋技术的一项非常关键的指标。测定包封率的前提是将未包被的芯材物与脂质体分离。脂质体的分离方法有很多种，主要有超速离心法、透析法、凝胶过滤法、超膜过滤法及微型柱分离法等。脂质体的分离方法凝胶柱过滤法 选用 Sephadex G-25 凝胶柱进行分离。取 1mL 脂质体混悬液进行上样分离，采用一定的洗脱剂洗脱，洗脱速度控制在 0.5-1.0mLmin-1，进行分部收集，测定游离的葵花籽降压肽总量，计算包封率。透析法准确吸取 1 mL 脂质体悬浮液移至透析袋中（截留分子量 5000 D），悬于 100 mL 磷酸盐缓冲液（pH 7.0，0.05 M）中透析 8 h，慢速搅拌。测定透析外液中的降压肽总量，即为游离葵花籽降压肽总量，计算包封率。2.7 Determination of entrapment efficiencyThe amount of unassociated peptides (W1) was determined according to Panico et al (1993) with some modifications, by reaction of the supernatant solution obtained from centrifugation (10,000g, 30min) with Cu2+ and bicinchoninic acid (BCA), and evaluation of absorbance increase at 562 nm. Empty liposomes were used as blank cuvettes in order to correct for turbidity effect. A standard working curve was constructed from bovine serum albumin (BSA). The incorporation of peptides (W2) into liposomes after the two washing cycles was added some methanol in order to disruption liposome wall, and calculated by the difference from the initial amount of peptides added. The %entrapment was calculated according to the following equation: % entrapment = W2/(W1+W2)100.Panico, A.M., Pignatello, R., Mazzone, S., Cardile, V., Bindoni, M., Cordopatri, F., Villari, A., Micali, N. and Mazzone, G. (1993) Lipid vesicles loaded with thymopentin: characterization and in vitro activity on tumoral cells. Int. J. Pharm. 98, 19-28.对包封率的测定游离的肽的量（W1）是根据Panico等人（1993）确定了一些修改,通过从离心上清液溶液反应（万克，30min）与Cu2+和二辛可宁酸（BCA），并在562 nm处的吸光度增加评价。空白