miRNA 荧光定量方法.doc

加尾反转录法则是利用poly(A)聚合酶为成熟的miRNA加上poly(A)尾巴，然后用锚定引物进行反转录，获得加长cDNA的第一链。最后使用与通用标签序列互补的反向引物对miRNA表达进行荧光定量PCR检测。这种可以批量将所有成熟miRNA加上poly(A)尾巴，然后进行反转录和检测。茎环反转录法利用可以折叠成茎环结构的引物，通过与miRNA的3端碱基互补进行反转录，生成cDNA第一链，进行荧光定量PCR检测，该方法是将反转录引物设计成茎环结构，所以特异性和灵敏性较高，可以有效区分只相差几个碱基的同家族miRNA的不同成员，茎环反转录法对引物的要求较高，需要引物在反转录阶段形成茎环式的正确构型。miRNA实时荧光定量PCR关键词：miRNA实时荧光定量PCR2013-12-02 00:00来源：互联网点击次数：1101实时荧光定量PCR从1996年美国AppliedBiosystems公司推出实时荧光定量PCR技术以来，该技术已经越来越广泛的应用到各类RNA的研究中，成为研究RNA必不可少的实验手段之一。目前比较常用的方法有两种：（1）TaqMan荧光探针法：该方法在特异性探针的两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，荧光基团发光被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，探针被降解，荧光基团与淬灭基团分离，发出可被检测到的荧光，以此来监测整个PCR过程。（2）SYBR荧光染料法：该方法利用了SYBRGreen荧光染料非特异性与双链DNA结合并发光的特性，检测PCR的全部进程，从而判定初始RNA的量。常用的miRNA第一链合成方法成熟的miRNA大小只有22 nt左右，在用实时荧光定量PCR检测miRNA时，难点在于如何识别如此小的miRNA并合成第一链。目前常用的用于识别并合成miRNA第一链的方法主要有颈环法和加尾法两种。（1）颈环法原理图（2）加尾法原理图由于成熟miRNA较小，无法用常规的方法直接进行反转录、PCR。所以上述两种方法分别加PolyA尾及颈环结构的方法，将miRNA配对的序列延长，然后进行正常的反转录及后续的PCR检测。颈环法只针对成熟miRNA，特异性相对较高，但操作繁琐，成本较高；加尾法可以检测到成熟miRNA及pre-miRNA，特异性稍低，但操作及引物设计简单。分段探针捕获miRNA近年来，研究人员发现了越来越多的miRNA，其中有很多miRNA序列相近，有的仅仅只有一个碱基差异。这些不同的miRNA虽然序列相近，但是也有着不同的来源及功能。上述两种方法虽然解决了miRNA的识别及后续PCR问题，但是无法分辨这些只有一个或者两个碱基差异的miRNA。美国Signosis推出了一种新的miRNA识别方法，可以分辨仅有单个碱基差异的miRNA。美国Signosis推出的新方法，使用多对寡核苷酸对目的miRNA进行识别，单个碱基差异就可以破坏寡核苷酸与靶标序列的结合，从而分辨单个碱基差异的miRNA；同时该方法不用进行方转录，避免了反转录过程中出现错配的可能；同时，这个新方法还引入了磁珠分离技术，在进行PCR前，通过结合有链霉亲和素的磁珠对特异性标记有生物素的靶标序列进行纯化，大大提高了特异性。武汉中帜生物携手美国Signosis，为广大科研用户提供特异性更高、分辨率更强的miRNA实时荧光定量PCR检测试剂。来源： 与杂交方法相比，实时荧光定量PCR方法可以高度灵敏地检测出低丰度的靶miRNA。Signosis应用T7-OLA（寡核苷酸连接）专利技术和SYBR green实时荧光定量PCR技术，开发了一种高灵敏度、高分辨力的实时荧光定量PCR试验方法，可直接对细胞裂解产物中的miRNA表达进行定量分析，无需总RNA提取和cDNA反转录。A.产品优势无需RNA制备细胞裂解产物可直接用于实验（总RNA亦可）；分辨率高能分辨仅有单个碱基差异的miRNA；实时分析可以实时监测；自有专利应用T7-OLA（寡核苷酸连接）专利技术。B.技术原理 靶miRNA分子与两条寡核苷酸（oligo）连接，形成RNA/DNA杂合体。含有生物素（biotin，B）的短序列互补结合到其中的一个oligo上。通过结合有链霉亲和素（Streptavidin）的磁珠分离出杂合体。用DNA连接酶连接两条oligo。单个核苷酸的差异就会阻止杂合体的形成或两条oligo的连接。寡核苷酸对连接上后，连接分子可进行实时荧光定量PCR。C.原理示意图D.结果展示用miR-17-92基因簇实时荧光定量PCR检测试剂分析HeLa细胞和MCF7细胞中的miRNA17-92基因簇表达情况。E.产品应用实例1) MicroRNA-17-5p post-transcriptionally regulates p21 expression in irradiated betel quid chewing-related oral squamous cell carcinoma cells. Wu SY, Lin KC, Chiou JF, Jeng SC, Cheng WH, Chang CL, Lin WC, Wu LL, Lee HL, Chen RJ. Strahlenther Onkol., 2013 JunEpub ahead of print.Molecular basis of cardiac endothelial-to-mesenchymal transition(EndMT): differential expression o