第四章-2 培养基.ppt

1 苯乙酸在青霉素发酵培养基中的作用是 A 诱导剂B 氮源C 前体D 消泡剂 2 尿素用来制备培养基 是做为 A 碳源B 氮源C 诱导剂D 消泡剂 3 在培养基的配制过程中 具有如下步骤 其正确顺序为 溶化 调pH 加棉塞 包扎 培养基的分装 称量A B C D 4 以下哪种不是常用的无机氮源 A 铵盐B 硝酸盐C 氨水D 尿素 5 下列营养物质中 不是同时含有碳源 氮源和生长因子的是 A 牛肉膏B 蛋白胨C 生物素D 酵母粉 有机氮源的作用生理酸性物质 生理碱性物质 举例 生长因子 三 发酵培养基的设计和优化 培养基的选择首先是培养基成分的确定 再决定各组分之间的最佳配比 一 培养基成分选择的原则 菌种的同化能力 代谢的阻遏和诱导 合适的C N比 pH的要求 1 菌体的同化能力 小分子进入细胞大分子水解为小分子 2 代谢的阻遏和诱导 碳源 葡萄糖效应 抑制产物的合成 氮源 蛋白酶的生产 受培养基中蛋白质或多肽的诱导 而受铵盐 硝酸盐 氨基酸的阻遏 3 合适的碳氮比 碳氮比对生长繁殖以及产物合成的影响极其显著 氮源过多 会使菌体生长过旺 pH偏高 不利代谢产物的积累 氮源不足 则菌体繁殖量少 从而影响产量 碳源过多则易形成较低的pH 碳源不足则容易引起菌体的衰老和自溶 3 合适的C N比 4 pH的要求 培养体系pH的波动发酵过程中一般不主张直接用酸碱来调节pH 要保证在发酵过程中pH值满足工业的要求 合理配制培养基是决定因素 因而在配制培养基时 要考虑代谢后对培养体系pH的贡献 从而保证整个发酵过程中pH值处于较为适宜的状态 二 培养基的设计 已知组成微生物细胞的元素包括C H O N S P Fe Mg K等 在设计各种培养基 孢子培养基 种子培养基 发酵培养基 时 要充分考虑细胞的元素组成状况 同时要考虑微生物对某些生长因子的特殊需求 以满足菌体的正常生长繁殖 还要认真分析组成代谢产物的元素种类和数量 同时分析各种营养物质与代谢产物合成的内在联系 一 理论转化率的计算 理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料平衡计算 所得出的转化率的大小 实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小 理论转化率可以通过反应方程式的物料衡算得出 例如青霉素生产中的代谢总反应方程式如下 葡萄糖转化为青霉素的理论得率为 发酵培养基 二 实验设计 培养基成分的含量最终都是通过实验获得的 合理的实验方法 多因子实验 均匀设计正交实验设计 响应面分析等 单因子实验 摇瓶优化配方 菌种筛选 反应器研究的基础 发酵培养基的设计和优化 发酵罐 反应器水平 可以得出最终优化的基础配方 1 1正交试验设计的基本概念正交试验设计是利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法 它是由试验因素的全部水平组合中 挑选部分有代表性的水平组合进行试验的 通过对这部分试验结果的分析了解全面试验的情况 找出最优的水平组合 1正交试验设计 L9 34 例 酵母产 氨基丁酸发酵培养基的优化 现代生物医学进展 11 3 482 484 氨基丁酸 GABA 是人体和动植物生命活动中一种非常重要的非蛋白质氨基酸 植物抵御逆境胁迫反应及对病 虫害有保卫反应等过程都涉及GABA的参与 GABA作为动物中枢的抑制性神经递质 不仅具有镇静 降血压 抗惊厥等生理作用 在非神经的组织中还能发挥激素或营养因子的功能 对动物机体正常的生理功能起着重要的调节作用 本实验以高产GABA的酵母突变株为材料 采用单因素和正交设计实验对菌株产 氨基丁酸的培养基进行了优化 以期提高GABA的产率 碳源选择 有机氮源的选择 无机氮源的选择 无机盐 正交试验设计L9 34 极差分析结果表明 四个因素对发酵液中GABA含量的影响是A B D C 即培养基中碳源量对GABA的生成影响最显著 蛋白胨次之 硫酸铵和KH2PO4影响程度相差不大 由表可知四个因素的最佳组合为A2B2C3D1 在最佳培养基配方条件下连续3次发酵 氨基丁酸含量可达1 690g L 1 正交试验设计是利用具有正交性的表格 正交表来安排试验 使试验点具有 均衡分散 综合可比 的特点 均衡分散 即均匀性 使试验均匀分布在试验范围内 每个试验点都具有一定的代表性 实现以部分试验反映全面试验的情况 大大减少试验次数 综合可比性 使试验结果的分析十分方便 以利于分析各因素及其交互作用对试验指标的影响大小及规律性 问题的提出 2均匀试验设计 为了保证综合可比性 对任意2个因素而言必须是全面试验 每个因素的水平必须有重复 这样的试验点在试验范围内就不能充分均匀分散 即试验点数不能过少 对于水平数为t的正交试验 至少要做t2次试验 当水平数t较大时 t2会很大 试验次数会很多 例如 t 9 t2 81 即试验至少要做81种组合 这在实际中是难以实施的 因此 正交试验设计只适用于因素水平不太多的多因素试验 综上所述 正交试验设计为保证 综合可比性 在相同的试验组合数下 使均匀性受到一定限制 试验点的代表性还不够强 试验次数不能充分的少 正交试验设计存在的不足之处 如果不考虑综合可比性 而完全保证均匀性 让试验点在试验范围内充分地均匀分散 不仅可大大减少试验点 而且仍能得到反映试验体系主要特征的实验结果 这种完全从均匀性出发的试验设计 称为均匀试验设计 uniformdesign 均匀试验设计的基本思想 均匀试验设计的特点 例如74试验 全面试验要做2401次 正交试验也至少要做72 49次试验 而用均匀试验仅需7次 因此 对于多水平的多因素试验 试验费用昂贵或实际情况要求尽量少做试验的场合 或筛选因素及收缩试验范围进行逐步寻优的情况 均匀设计都是十分有效的试验设计方法 1 在因素水平较多的情况下 可以节省大量的试验工作量 对其试验结果的处理不能采用极差或方差分析 而必须用回归分析 所以试验结果处理较为复杂 这是均匀设计的一个缺点 2 均匀设计的试验结果不具有综合可比性 均匀设计表 与正交试验设计相似 均匀设计也是利用一种表格来安排试验的 我们称之为均匀设计表 tableofuniformdesign 简称为均匀表 等水平均匀设计表 各符号的含义如下 表7 1U5 54 均匀表 7 2均匀设计表 3 等水平均匀设计表的特点 每个因素的每个水平只做1次试验 表7 1是一张最简单的等水平均匀设计表U5 54 它最多可安排4个因素 每个因素5个水平 共做5次试验 任意2个因素组成的试验组合画在平面格子点上 每行每列恰好有1个试验点 a b 图7 1均匀表不同列的组合分布 例如将U5 54 第1 第2列 以及第1 第4列各水平的组合分别画在如图7 1 a 和图 b 所示的平面格子点上 显然 每行每列恰好有1个试验点 等水平均匀表任意两列之间组成的方案不一定是平等的 由图7 1可以看出 图 a 中试验点的分布比图 b 中的均匀性要好 因此 使用均匀设计表时不能随意挑选列 而应选择均匀性比较好的列 具体设计时应该怎么办 一定要根据等水平均匀设计表的使用表安排试验 表7 1U5 54 均匀表 表7 2U5 54 的使用表 均匀设计表 都附带一个使用表 进行设计时必须遵循使用表的规定 才能达到好的效果 表7 2为均匀设计表U5 54 的使用表 它规定我们在利用U5 54 表进行均匀试验时 若有2个因素 应该用第1 第2列 若有3个因素 应该用第1 第2 第4列 例如t 7 8 均匀设计n 7 8 随着水平数的增加 试验次数的增加具有连续性 正交设计n 49 64 随着水平数的增加 试验次数的增加有跳跃性 均匀设计中增加因素水平时 仅使试验工作稍有增加 这是均匀设计的最大优点 等水平均匀表的试验次数与该表的水平数相等 当水平数增加时 试验次数也随之增加 4 选择均匀设计表 根据因素个数以及确定的试验次数 每个因素可取10个水平 选取的因素水平如表7 9所示 故选用U10 1010 均匀表 表7 9发酵法生产肌苷试验因素水平表 5 制定试验方案 并进行实验 根据U10 1010 表的使用表 当5个因素时 应安排1 2 3 5 7列上 因此将x1 x2 x3 x4和x5分别安排在第1 第2 第3 第5 第7列上 再把每列的水平代码换成相应因素的水平值 即得到试验方案如表7 10 表7 10肌苷生产均匀设计试验方案及结果 6 试验结果分析 a 回归系数的求解 对试验结果 采用MicrosoftExcel回归分析工具软件处理 得自变量x1 x2 x3 x4 x5的回归系数如下表 表7 10肌苷制备均匀设计试验方案及结果 表7 11肌苷制备试验结果回归分析 注 F0 01 5 4 15 52F0 05 5 4 6 26F0 25 5 4 2 07 c 回归方程的显著性检验 经F检验 F 1 67 F0 05 5 4 6 26 所以回归方程不显著 求解回归系数 建立回归方程 设 拟构造的回归方程为二次项 其表达形式如下 肌苷制备试验数据组成表 根据上述试验数据组成进行回归计算 得自变量x1 x2 x4 x5 x11 x33 x44 x55的回归系数如下 回归方程显著性检验 注 F0 01 8 1 5981F0 05 8 1 239 经F检验 F 3551 35 F0 05 8 1 238 表明所建立的回归方程显著 根据方程的极值条件 获得最佳组合条件 利用响应面法优化放线菌素X2发酵培养基 响应曲面设计方法 ResponseSurfaceMethodology RSM 是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据 采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系 通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数 解决多变量问题的一种统计方法 什么是RSM 3 1 1应用全因子实验设计筛选重要因素选用四因素二水平全因子实验设计筛选影响链霉菌702产放线菌素的重要因素 需要16次实验 中心点做4次重复实验 共需20次实验 每个实验做三个重复 实验结果中的生物效价取三个重复的平均值 实验设计及实验结果见表1和表2 通过SASVersion6 2软件进行回归分析可以得到一次拟合回归方程为 Y 186 85 1 621X1 11 95X2 13 51X3 0 38X4由表4可知 F检验非常显著 用方程描述各因子与响应值之间的关系时 其因变量与全体自变量之间的线性关系显著 且X2因素 黄豆饼粉 和X3因素 工业蛋白胨 对链霉菌702产放线菌素影响极显著 而其余两因素对链霉菌702产放线菌素影响不显著 3 1 2应用最陡爬坡实验法接近重要因素的最优水平最陡爬坡的方向可由上述方程及回归分析确定 Y 186 85 1 621X1 11 95X2 13 51X3 0 38X4这说明 适当增加黄豆饼粉和工业蛋白胨的用量 对放线菌素的产量提高有促进作用 实验设计及实验结果见表5 从表5中可以看出 第5组实验中放线菌素的生物效价最高 这说明 最优点在第5组实验附近 3 1 3应用中心复合设计确定重要因素的最优水平采用响应面分析方法 以黄豆饼粉 工业蛋白胨二因素为自变量 以放线菌素的产量为响应值 对链霉菌702的发酵培养基组成进行优化 采用中心复合设计 以表5的第5组实验为中心点 实验设计及实验结果见6 通过SASVersion6 2软件对实验数据进行多项式回归分析 拟合的二次方程模型为 Y 998 15 94 80 x2 290 06x3 26 16x22 7 551x32 40 63x2x3对方程用MATLAB6 5软件进行求导 可以得到模型的极值点 即黄豆饼粉23g L x2 1 414 工业蛋白胨9g L x3 1 414 时生物效价为1556 g mL 但此仅为模型预测值 因此需要实际发酵验证 模型验证及与优化前的培养基比较见表8 数学回归模型的方差分析见表 由表 回归模型在 0 01水平上 检验极显著 图 绘出了方程的三维响应面图 直观的表示出了最大值点 3 1 4验证实验由表8可知 在该模型处做四次试验验证 得出响应量为1556 100 g mL 此结果证实了模型有效性及存在着极大值点 第四节影响培养基质量的因素 一 原材料质量的影响有机氮源 加工用的原材料品种 产地 加工方法和储存条件 黄豆饼粉 玉米浆 蛋白胨等 质量控制 监测各种有机氮源中的蛋白质 磷 脂肪和水分的含量 注意酸价变化 重视储藏温度和时间碳源 淀粉 葡萄糖和乳糖 不同的原料 产地 加工方法油脂 原料 豆油 玉米油 米糠油 杂鱼油 以及储藏条件和时间的影响无机盐和前体物 二 水质的影响大生产中使用的水有深井水 自来水 地表水和蒸馏水 含有的无机离子和有机物的含量不同 措施 定期检测水质 地表水应经过适当的处理 三 灭菌的影响工业发酵中常采用饱和蒸汽灭菌方法杀灭培养基中的有机体 糖类 还原糖 与氨基酸 赖氨酸 肽类或蛋白质等有机氮源一起