细胞遗传学实验室诊断技术简介

细胞遗传学实验室诊断技术简介 概念 细胞遗传学实验室诊断是通过组织细胞培养进行传统染色体分析的过程 是对染色体病及肿瘤进行诊断的主要方法 由于只能从具有分裂能力的细胞中得到染色体 但不是所以组织标本中都有足量的具有分裂能力的细胞 所以 细胞培养是细胞遗传学诊断的关键步骤 基本概念 染色质是由DNA 组蛋白 非组蛋白和少量RNA组成的线性复合结构 在间期细胞核内能被碱性染料着色 染色体是细胞在有丝分裂或减数分裂过程中 染色质聚缩而成的麻花棒状结构 染色体是细胞分裂时出现的一种重要的形态结构 是遗传物质的载体 其结构和数目的完整性对维持正常代谢活动和繁衍后代非常重要 具有分裂能力的细胞 即有核的活细胞 实验室常用的具有分裂能力的细胞 外周血淋巴细胞骨髓细胞羊水细胞绒毛膜细胞实质性活检组织细胞 如皮肤成纤维细胞癌细胞进入母体循环的胎儿淋巴细胞 1 5000 1 20000 细胞培养的优势 为细胞遗传诊断提供分裂中期细胞以进行染色体核型分析 为生化或分子遗传诊断提供足够量的细胞 制作特殊细胞系并将其长期冷藏保存 细胞遗传学诊断实验室流水图 标本取样 活细胞 培养液 抗生素 分裂素 细胞培养 最适应温度 酸碱度 湿度 时间 收获 终止细胞分裂 低渗 固定 滴片 显带染色 无菌操作 核型分析 培养准备 一 标本的收集和处理 外周血的收集和处理 酒精灯下无菌操作无菌肝素锂 钠抗凝管采血3 5ml即刻颠倒混匀3 5次保存 室温或4 冰箱注 1 尽管血中淋巴细胞可在抽血后数天内保存活力 但为了保证细胞培养的质量 均要求标本在抽血后24h内接种处理 2 凝固后的血培养成功机会甚微 故实验室应拒绝接收已凝固的血标本 骨髓的收集和处理 与外周血基本相同骨髓中有丰富的可自我分裂的原始细胞 培养时不需使用分裂素来刺激细胞生长分裂 符合血液肿瘤细胞遗传诊断的要求 一旦标本到达诊断实验室 必须立即作种植培养处理 以避免具有自我分裂能力的细胞死亡 应该设法收集最初吸出的骨髓 因为其中含活力细胞最多 羊水的收集 临床大夫B超定点 无菌操作 将先抽出2ml羊水丢弃 防止母体细胞污染 再换用20ml无菌注射器抽取羊水20ml 抽取出的羊水应为清亮透明呈淡黄色 即刻送检培养 生物安全柜内无菌操作 将羊水注入无菌离心管中 离心分离细胞 1500rpm8分钟 弃上清留0 5 1ml 将沉淀细胞吹打混匀 制成细胞悬液 将混匀的羊水细胞悬液平均接种入50ml细胞培养瓶 规格为25cm2的聚苯乙烯培养瓶 中 每瓶加入5ml羊水完全培养液 GIBCOAmnioMAX 培养液 每份羊水标本接种2瓶 5 7天后观察细胞生长情况 染色体的制备 方法学及原理 染色体显带技术 用一些特定的染料和处理技术 来使染色体出现深浅或明暗带纹以鉴别染色体的技术称为染色体显带技术 chromosomebanding 一 G显带法 Gbanding 目前实验室使用最广泛的一种显带方法原理 各条染色体上不同的区域含不同比例的A T G C碱基 经过胰蛋白酶消化处理后 染色体里的DNA暴露 由于Giemsa染料对A T碱基的亲和比对G C碱基强 从而使得染色体呈现恒定的深浅不一的条纹 本技术根据Giemsa的第一个字母命名为G带 特点 操作简单 普通显微镜下即可观察深带浅带 带纹清晰 标本可长期保存 稳定性和重复性好 人类G显带染色体模式图 G带核型 二 Q显带法 Qbanding Q带是最先发表最早使用的显带方法使用芥子奎吖因和二盐酸奎吖因等荧光染料产生的荧光带型 即Q显带方法 显出Q带 在荧光显微镜下 可见染色体臂上有明暗相间的横纹 Q带的亮带对应G带的深带 暗带对应G带的浅带 带型Q 特点 显带效果稳定在荧光镜下黄光亮暗带形 AT DNA亮带 GC DNA暗带 对Y染色体的长臂远侧显示亮的荧光 缺点 条纹带界限不清 荧光持续时间短 很快消失无法长久保存 只能以照片保存下来 三 R带或称反带 reversebanding 染色体标本经热磷酸盐 80 90 处理后 用吉姆萨染料染色显示的带纹叫R带 R带的带纹与G带相反 即R带是深染部分 G带呈浅染 对于G Q显带的染色体 两臂末端均为浅带或不显示荧光 在R带则被染色 因此 R带有利于测定染色体长度 观察末端区的结构 一般R显带主要用于研究染色体末端缺失和结构重排 通常用R显带来观察G显带时浅带的缺失 临床实验室常用于观察骨髓染色体末端的浅带缺失 四 C显带法 Cbanding 原理 每一条染色体的着丝粒的两侧都含丰富的结构性异染色质 而染色体两臂含常染色质 经过强碱Ba OH 2和盐溶液处理后 Giemsa染料只对结构性染色质深染 而对常染色质淡染 此特异性着色称C显带 以constitutive第一各字母取名 也称着丝粒显带 用途 C带技术通常用以检测着丝粒区 次缢痕区及Y染色体结构上的变化 还可评估细小而来源不明的标志染体的临床意义 临床实验室常用于观察1 9 16号染色体的次縊痕及Y染色体长臂远端区段 C带均呈深染状态 染色区域的大小在不同个体间差异很大 C显带核型图 五 高级分辨显带技术 一 高分辨带 方法 使培养中的细胞同步化或去同步化 再通过短时间的秋水仙素处理 以得到后早期或早中期细胞分裂相 得到的染色体带水平可高达800 1400条 用途 诊断微小的结构性染色体畸变 二 Ag NOR染色技术 即银染 通过使用硝酸银溶液选择性地对位于近端着丝粒染色体短臂蒂上的蛋白质进行染色 凡是Ag NOR染色阳性 呈黑色 的 表明该区的18S和28SrRNA具有活性 NOR显带的目的是为了观察染色体的核仁组织区 镜下可见D G组染色体隨体呈黑色 相关知识链接 染色体的多态性定义 不同个体之间的染色体结构和染色的着色强度都存在着很队当属非病理性的细小差别 称为染色体的多态性 到目前为止 还没有发现染色体多态性能导致有害的遗传性状 分类 按孟德尔方式从亲代向子代传递 主要分为三种1 倒位结构多态性 如2 染色多态性 如异染色质区域3 隨体多态性 不同个体的近端着丝粒染色体的隨体数量及大小都不同 有的隨体大或呈双隨体结构 有的很小甚至缺如 一般隨体的数量在2 10个之间 37 72h 实验步骤 外周血 骨髓细胞染色体制备 细胞培养系统 无污染环境 无毒和无菌是保证细胞体外生存的首要条件37 恒温 一定的湿度细胞培养液PH浓度 大多数细胞的适宜PH为7 2 7 4 偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响 细胞培养基 一般含血清 缓冲系统 碳水化合物 氨基酸 脂类 无机盐 维生素 微量元素及广谱抗菌素等 血清中含有多种促细胞生长因子 促贴附因子及其多种活性物质 是培养基中最重要的成分 现以小牛血清使用最普遍 常见使用浓度为5 20 常用培养基有 RPMI1640 F10等 气体环境 气体是人体细胞培养生存必需条件之一 所需气体主要有氧气和二氧化碳 开放培养时一般把细胞置于95 空气加5 二氧化碳混合气体环境中 二氧化碳在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值 培养时间 植物血凝素 PHA PHA是一种促细胞分裂原 在体外能刺激淋巴细胞有丝分裂 其剂量在100 200微克 ML即可制的分裂指数较高的染色体标本 其它作用 能诱导白介素 诱导产生免疫干扰素和白细胞抑制因子 有丝分裂抑制素 目前使用最广泛的是秋水仙素或秋水酰胺 作用浓度0 02 0 04ug ml可抑制纺锤体的合成 使细胞的有丝分裂停留在分裂中期其浓度和对细胞的作用时间 与收获到的中期细胞染色体的形态关系密切 在一定浓度下 秋碱作用的时间越长 中期细胞越多 但染色体越短 低渗 低渗处理是制备染色体时使细胞破裂 染色体均匀分布的关键步骤 通过渗透作用使细胞膨胀变大 处理时间很重要 时间太短不能使细胞充分膨胀 而使染色体交叉或呈团状 时间太长则会使细胞过度膨胀而破裂 造成染色体分散过度导致染色体丢失 目前实验室最常用的低渗液 0 075mol 0 04molKCl 0 8 枸橼酸钠 KCl 枸橼酸钠混合液等 细胞固定 固定液可使细胞蛋白变性 使细胞固定在膨胀状态 最常用的固定液 甲醇 冰醋酸混合液 3 1 固定液能吸收空气中的水分从而影响固定作用 因此每次使用前应新鲜配制且注意保持密封 固定时间直接影响染色体的形态和分散度 制片时至少应进行两次固定且每次不少于15分 滴片 滴片是将经固定的细胞悬液滴在预先准备好的洁净玻片上使染色体分散 原位培养法无需此步骤 理想的滴片应该是 有足够多的中期分裂相 细胞密度适宜 染色体分布均匀 交叉少 染色体形态清晰且直 镜下看不到细胞质 影响因素 环境温度 湿度 玻片洁净度 滴片距离及角度等 滴片后需将标本片进行干燥处理 80 2h 染片 37 0 025 胰蛋白酶显带 30 50秒 2 5 Giemsa染液染片5 10分钟核型分析 镜下分