核酸检测篇-3-基因芯片.docx

编号：2-3主题：基因芯片 概述：基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于 400 ）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微加工技术 ，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于2cm2 的硅片、玻片 等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，与计算机的电子芯片十分相似，所以被称为基因芯片。基因芯片主要用于基因检测工作 。基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1）固定在聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致，相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。2）用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。3）在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。目的：基因功能的研究。通过基因芯片可以大规模，高通量地对成千上万个基因进行同时研究。原理：基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针，当溶液中带有荧光标记的核酸序列，例如TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。基因芯片的测序原理图步骤：1.样品的准备：由于灵敏度所限，多数方法需要在标记和分析前对样品进行适当的扩增。2.杂交检测，显色和分析测定方法主要为荧光法，其重复性较好，但灵敏度较低。目前正在发展的方法有质谱法、化学发光法、光导纤维法等。以荧光法为例，当前主要的检测手段是激光共聚焦显微扫描技术，以便于对高密度探针阵列每个位点的荧光强度进行定量分析。3. 结果分析：3.1. 差异表达基因分析和聚类分析基因芯片数据标准化、上调基因/下调基因、t-检验（P值）、方差分析（F-检验）、基因聚类（Cluster）、热图（Heatmap）、多样本分子标志物聚类（如肿瘤分子标志物聚类分析）。可分析mRNA表达谱、miRNA表达谱和甲基化基因芯片数据表达谱差异。 3.2. 基因数据相关性分析分析内容：基因芯片数据质量控制和分析（结果形式：相关性分析结果表格） 3.3. GO分析（Gene Ontology）意义：了解差异基因所调控的生物学功能中哪些是最重要的, 哪些生物学过程需要深入研究，哪些酶的活性需要重点关注等。分析内容：包含基因芯片内所有差异表达基因的GO功能注释（结果形式：注释表格）和GO功能富集分析图）。3.4. Pathway分析及其富集分析意义：了解差异基因影响的主要信号通路调控机制和重点调控的蛋白。分析内容：最重要的几个差异基因相关的KEGG代谢通路图、表示通路被调控程度的热图，（结果形式：p